[发明专利]基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于川芎转录组序列开发的EST‑SSR标记引物组、其获取方法及应用，本发明基于川芎转录组序列开发的EST‑SSR标记引物组包括74对引物，其中各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148所示。本发明首次公开了川芎EST‑SSR标记引物组，该引物经验证后得到多态性较高的74对EST‑SSR，与通用引物相比，川芎EST‑SSR标记引物组具有多态性高，易扩增，重复性好，结果更准确等优点，可用于后续川芎的遗传图谱构建、川芎品种指纹图谱构建等基础研究，促进川芎分子育种和功能基因发掘、中药品种标准化等应用研究。

技术领域

本发明属于分子标记技术开发及应用的技术领域，更具体地，涉及一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法及应用。

背景技术

川芎为是伞形科藁本属药用植物，主要种植于四川彭州，都江堰等地，是我国著名传统中药材，以其干燥根茎入药，其味辛，性温，有活血行气、祛风止痛功效，用于治疗头痛、风湿、月经不调等。

川芎有效成分研究十分深入，研究者分离出了包括川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯等多种有效成分。检索川芎研究文献结果显示，对川芎活性成分提取，药理药性上的研究较多。对川芎遗传多样性、种质指纹图谱、基因定位、遗传图谱构建、分子育种等研究却鲜有报道，川芎中能够用于上述研究的分子标记甚少，都是一些通用引物，如RAPD、ISSR、ITS等，使得川芎分子研究难以深入，严重限制了川芎优质种质资源快速、有效的选育及生产应用。

微卫星序列又称简单重复序列(SSR)、短串联重复序列，由若干个串联重复单元组成，每单元含1-10个核苷酸，广泛分布在真核生物基因组中(9-10)。SSR具有标记之间密度大、材料间多态性好、易扩增、重复性高等优点，已被广泛在水稻，玉米，小麦等作物上应用。SSR按来源分为两类genome-SSR和EST-SSR，随着EST数据库的不断丰富，EST-SSR被大量开发。截止目前，药用植物已有红花、丹参、党参、人参、西洋参、金银花等开发了EST-SSR，逐渐代替通用引物应用于遗传多样性、道地性鉴定等研究。

近年来二代测序飞速发展，成本急剧降低。使得利用转录组测序开发EST-SSR成为一种便捷高效的手段。但目前还未有利用川芎转SSR标记引物的报道。因此，利用转录组数据批量开发川芎EST-SSR引物。该标记能直接用于川芎种质资源指纹图谱构建、遗传作图、基因定位和比较基因组学研究，对川芎品种的标准化、真伪品种的鉴定、分子标记辅助选择育种都有重要作用。

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组、其获取方法及应用。

本发明提供了一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组，所述引物组包括74对引物，其中各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148所示。

本发明还提供了一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，该方法包括以下步骤：

(1)对川芎转录组测序数据拼接，拼接去冗余得到unigene；

(2)利用MISA软件对拼接到的unigene进行SSR位点发掘；

(3)利用Primer 3.0软件对上述SSR检测结果进行引物设计，得到设计的EST-SSR引物；

(4)采用CTAB方法提取川芎的基因组DNA，用设计的EST-SSR引物对川芎DNA进行PCR扩增，然后进行毛细管电泳，根据电泳结果数据筛选出EST-SSR标记引物组。

进一步的，步骤(2)中，SSR位点发掘时的基本参数设置为：单核苷酸至少重复10次，双核苷酸至少重复6次，三核苷酸至少重复5次，四核苷酸至少重复5次，五核苷酸至少重复5次，六核苷酸至少重复5次。