[发明专利]一种利用荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法有效
| 申请号： | 201610967626.9 | 申请日： | 2016-10-31 |
| 公开（公告）号： | CN106525793B | 公开（公告）日： | 2019-06-21 |
| 发明（设计）人： | 闫亚平;秦李娜;李科 | 申请（专利权）人： | 陕西脉元生物科技有限公司 |
| 主分类号： | G01N21/64 | 分类号： | G01N21/64;G01N33/573 |
| 代理公司： | 西安通大专利代理有限责任公司 61200 | 代理人： | 王霞 |
| 地址： | 710065 陕西省西安市高新区*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 血清样本 检测 荧光酶 印迹法 硝酸纤维素膜 印迹技术 荧光 降解 蛋白 浓缩 待检测样品 检测灵敏度 明胶酶谱法 电泳 淬灭基团 激发波长 离心操作 浓缩蛋白 荧光基团 酶活性 再利用 血清 底物 孵育 毛细 凝胶 固化 灵敏 生物技术 量化 保留 | ||
1.一种用于非诊断目的的荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）对待检测血清样本通过凝胶浓缩蛋白法，进行孵育离心操作，将待检测血清样本中的酶浓度提高5倍；
2）将浓缩后待检测血清样本采用荧光酶谱印迹法，通过电泳利用分子量区分出待检测样品中的各种酶及蛋白；
3）通过毛细管印迹法将步骤2）区分出的蛋白转移至硝酸纤维素膜表面，降解预先固化在硝酸纤维素膜表面的底物；
其中，预先在硝酸纤维素膜表面固化底物的操作为：将硝酸纤维素膜浸入0.1-1μM的底物液内3-5分钟，取出后于室温晾15-20分钟；所述底物为MCA-Pro-Arg-Ser-Leu-DPA-Ser-Gly-NH2；
4）底物被降解后，荧光基团与淬灭基团分离，在特异激发波长下发出荧光，通过检测荧光强度来判断待检测血清样本中MMP-9的酶活性。
2.根据权利要求1所述的用于非诊断目的的荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法，其特征在于，步骤1）中，凝胶浓缩蛋白法采用的浓缩介质为葡聚糖凝胶SephadexG-25干粉，葡聚糖凝胶SephadexG-25干粉与待检测血清样本的用量比为50mg：100μl。
3.根据权利要求1所述的用于非诊断目的的荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法，其特征在于，步骤1）中，孵育离心操作后，待检测血清样本的体积为初始体积的1/5。
4.根据权利要求1所述的用于非诊断目的的荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法，其特征在于，底物中MCA基团的最大激发波长为328nm，最大发射波长为393nm；DPA基团的最大激发波长为363nm，在410nm处有明显肩峰。
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