[发明专利]一种利用荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法

说明书

本发明公开了一种利用荧光酶谱印迹技术检测MMP‑9的方法，属于生物技术技术领域，包括：1)对待检测血清样本通过凝胶浓缩蛋白法，进行孵育离心操作，将待检测血清样本中的酶浓度提高5倍；2)将浓缩后待检测血清样本采用荧光酶谱印迹法，通过电泳利用分子量区分出待检测样品中的各种酶及蛋白；3)通过毛细印迹法将步骤2)区分出的蛋白转移至硝酸纤维素膜表面，降解预先固化在硝酸纤维素膜表面的底物；4)底部被降解后，荧光基团与淬灭基团分离，在特异激发波长下发出荧光，通过检测荧光强度来判断待检测血清样本中MMP9的酶活性。本发明在保留明胶酶谱法优势的前提下，先浓缩血清，提高了检测灵敏度。然后再利用荧光酶谱印迹法，使得实验结果背景低，更灵敏，且结果可量化。

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，涉及低浓度MMP-9样品酶活性检测方法，具体涉及一种利用荧光酶谱印迹技术检测MMP-9的方法。

背景技术

基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinase,MMP)是一组Ca²⁺/Zn²⁺依赖性中性蛋白酶，其主要功能是降解和重塑全身各种组织的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)，现已发现20多种。其中MMP2与MMP-9(明胶酶B)是基质金属蛋白酶家族中的重要成员，在一些病理过程中，这两种蛋白酶的异常激活，会降解参与血脑屏障基膜的主要成分层粘蛋白和纤粘蛋白等，破坏血脑屏障，引起血脑屏障的通透性升高或开放。

近年来研究表明MMP9与脑血管病关系密切，参与了缺血性卒中后炎症反应以及继发性脑损伤病理过程。在疾病早期检测MMPs的水平，有助于对疾病预后进行准确评估。如脑出血患者，在发病24小时内即可能检测出MMP9明显升高，并与脑水肿高峰一致。之后至72小时，MMP9的水平始终与血肿面积，水肿体积，病情严重程度呈正相关。一般认为早期即有MMP9水平高的患者预后不佳。如对MMP9水平高的患者及时干预，可能会减轻脑水肿及炎症带来的不良后果。因此对出血性疾病患者，快速准确的检测其体内MMPs蛋白酶家族，尤其是MMP9，的活性，有助于临床治疗方式的选择及准确预后评估。

MMP9在体内存在酶原和活性酶两种形式。MMP-9是以酶原的形式从胞内分泌到胞外。MMP9酶原没有酶活性，大小约为92-94KD。在生理或病理状态下，经过一系列蛋白酶(如MMP2，MMP3等)的级联反应被切除一小段肽而激活。活化的MMP9大小约为83KD。活化的MMP9可以通过a2球蛋白结合而被清除。MMP9酶原或活化形式与金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)结合而被抑制活性。TIMP与活化的MMP9结合时亲和力很高，在一般条件下难以分离。对MMP9的活性检测即是检测游离的激活后的MMP9的活性。

目前常用的MMP-9检测方法主要分为ELISA和明胶酶谱两种。其中ELISA方法可以分为两种，一种是以特异识别MMP9蛋白的一个或一组抗体，联合化学显色方法来识别样品中MMP9的浓度。由于目前抗体难以特异识别活化的MMP9，因此，此方法实际检测的是MMP9酶原形式及活化形式两者总体的浓度。另一种方式是用一个抗体将MMP9捕获至介质表面，在与MMP9的底物孵育，其中MMP9的底物已做化学分子或荧光分子标记，最后通过化学显色或荧光方法检测被捕获的MMP9的活性。此种方法可以排除酶原的干扰。但一方面抗体与MMP9结合，因空间位阻效应可能会影响酶与底物的识别效率。另一方面，血清中的成分比较复杂，存在MMP家族的其他蛋白酶，在催化部位与MMP9有共同的高序列同源性，只依靠底物序列难以区分各蛋白酶，因此此种方法的特异性完全依赖所选抗体的特异性。而实际检测过程中，血清中大量的蛋白及复杂的离子成分会严重干扰抗体的特异性。