[发明专利]一种来源于Aquifex aeolicus菌株的嗜热酯酶及其功能验证

说明书

本发明公开了一种来源于Aquifex aeolicus菌株的嗜热酯酶及其功能验证，属于生物工程技术领域。本发明发现了一种新的嗜热酯酶基因，构建3种表达系统，实现高效表达并研究酶学性质。真核表达系统构建：表达载体构建优选载体pPIC9K，并转化毕赤酵母宿主，优选GS115，实现高效表达；原核大肠杆菌表达系统构建：表达载体构建优选载体MBP3，并转化大肠杆菌宿主，优选BL21和Origami2，实现高效表达；原核巨大芽孢杆菌表达系统构建：表达载体构建优选载体pHIS1525，并转化巨大芽孢杆菌宿主，优选YYBm1，实现高效表达。所得重组酶具有酯酶活性以及嗜热性和热稳定性等优点，在高温条件下的工业应用中具有重大潜力。

技术领域

本发明涉及一种来源于Aquifex aeolicus菌株的嗜热酯酶及其功能验证，属于生物工程技术领域。

背景技术

极端微生物是适合生活在极端环境中的微生物的总称，包括嗜热、嗜冷、嗜酸、嗜碱、嗜压、嗜盐、嗜金属离子、抗辐射、耐干燥和极端厌氧等多种类型。嗜热菌(高温菌，也称嗜热微生物)，是一类生活在50℃以上高温环境中的微生物。常见的嗜热微生物的来源有温泉、火山口、海洋沉积物、废水废物、地热性土壤等。近30年来，在水的沸点和沸点以上温度条件下能生活的细菌被发现后，更促进了对嗜热微生物的研究。在发酵工业中，可以利用嗜热菌耐高温的特性，提高反应温度，增大反应速度，减少中温型杂菌污染的机会。最适反应温度低于80℃的称为嗜热酶，最适反应温度高于80℃的称为超嗜热酶，人类发现的第一个嗜热酶是应用于现代生物技术的聚合酶—Taq酶。此后，许多嗜热酶已不断被从嗜热菌中发现且用于生产，例如纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、菊糖酶等。

脂类水解酶(EC 3.1.1.X)主要包括脂肪酶和酯酶。脂肪酶和酯酶的区别主要有3点：一是作用的底物不同：酯酶是催化含短链脂肪酸的酯类水解酶，脂肪酶是催化含长链脂肪酸的脂肪(三酰基甘油)水解为甘油和脂肪酸的酶；二是作用底物的物理状态不同：酯酶水解水溶性底物，反应体系主要处于油水界面。脂肪酶只能在异相系统(即油水界面)或有机相中作用，水解脂溶性底物；三是界面的激活效应：脂肪酶在水-油界面催化活性较高，在单一溶液中催化活性低。所有的脂类水解酶一级结构都相似，包括1)重要区域His-Gly-X-Ser-Gly和Gly-X-Ser-X-Gly；2)活性部位的Ser被α-螺旋掩盖，当脂肪酶与界面接触时，α-螺旋打开。3)普遍认为其活性位点由3个催化残基组成：亲核残基(Ser、Cyc、Asp)、催化残基(Asp、Glu)、His残基。

近几年，关于耐热酯酶/脂肪酶的研究愈来愈多，许多嗜热菌株酯酶/脂肪酶已被研究。嗜热酯酶/脂肪酶微生物来源主要有原核生物、真核生物和古生菌。根据脂类水解酶氨基酸序列和基础生化性质的不同，Arpigny和Jaeger等人将细菌脂类水解酶分为8个家族，其中嗜热酶多属于第4家族(HSL家族)和第5家族(嗜热酶家族)。目前，国内外已研究的关于嗜热酯酶/脂肪酶来源的嗜热菌株主要有：Fervidobacterium属，Thermotoga属，Aureobasidium属，Pseudomonas属，Geobacillus属，Sulfolobus属等。酯酶作为一种高效的生物催化剂，由于嗜热酯酶具有高温反应活性和良好的热稳定性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，使其极广泛的应用于食品加工、医药工业、皮革制造、动物饲料、化妆品行业和污水治理等行业。

随着科学技术的进步，科学家们逐渐从一些特殊高热环境中分离得到超嗜热微生物，也从而使人们对嗜热酶的认识进一步深入。然而，大多数嗜热菌生长速度较慢，培养条件严格，因此通过培养野生菌来获得大量嗜热酶极其困难。然而，随着基因工程技术的发展，人们开始把在嗜热菌中发现的目的基因在一些常见的易培养宿主中表达，从而在温和条件下获得大量的嗜热酶。目前，已有一些嗜热酯酶基因实现在大肠杆菌中的成功表达。但在工业化生产应用中，考虑到酶制剂下游分离处理和安全问题，异源表达宿主的选择尤为重要。毕赤酵母和巨大芽孢杆菌都是食品级表达宿主，且可以胞外分泌重组蛋白。