[发明专利]人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的试剂盒及方法。

背景技术

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是由日本Yamanaka研究小组于2006年通过重编程技术成功创建。随后中外多家实验室利用转基因方法将多种类型的成体细胞重编程为iPSCs。iPSCs是通过基因转染技术将某些转录因子导入动物或人的体细胞，使体细胞直接重编程成为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)细胞样的多潜能细胞。iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。与ES细胞一样，iPSCs能形成密集的集落，并且具有多功能表达基因，表面具有与胚胎干细胞一样的抗原。不仅如此，iPSCs像胚胎干细胞一样具有多向分化潜能，在体内可以分化为3个胚层来源的所有细胞，进而参与形成机体所有组织和器官。基于iPSCs具有多潜能分化的特性，其在生物基础研究领域和生物医学领域都有着巨大的作用。在基础研究方面，利用iPSCs为发育生物学、基因与蛋白质功能分析等领域提供了重要的模型。获得的方法相对简单和稳定，在技术上更具有优势。在生物医学领域方面，如利用患者自身细胞所形成的iPSCs，将其进行特定细胞诱导分化后可以成为细胞的研究材料，解决以往人类组织细胞的提取难题。另外由于细胞来源于患者本身，其具有的“个别性”、“专一性”特性可以成为药剂或是药物毒理评估的最佳平台，也可成为转译医学的最佳测试材料。所以，iPSCs的制作与发现也同样成为了医学、药学以及食品的重要安全实验平台。

随着我国人口老龄化日趋严重，脑梗塞、阿尔兹海默病(AD)、帕金森病(PD)等中枢神经系统疾病发病率逐年增高，由于神经细胞受损后再生困难，从而影响了此类疾病的疗效，使得众多老年人晚年生活质量极差，同时也增加了家庭和国家的负担。最近使用细胞重编程技术将iPSCs诱导分化成特异性神经细胞为神经修复和治疗带来了希望。一方面将分化的神经细胞移植到大脑受损区域，可在一定程度上改善该区域神经损伤造成的功能障碍。另一方面使用病人的神经细胞进行相关疾病的机制研究和进行大规模的药物筛选以及为病人提供个性化的精准治疗。未来不管是临床治疗领域还是精准医疗领域都存在对iPSCs诱导神经细胞的大量需求，目前有许多通过干细胞生成神经细胞的方法大多是只在实验室里完成的，且神经细胞的分化效率低，价格高昂，细胞系之间的差异很大，不利于规模化生产和应用，不能满足安全、均质、精准医疗服务和药物检测行业的大量需要。

发明内容

本发明的一个目的在于克服现有技术的局限，提供一种iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的培养基，本发明采用的技术方案为：

一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为神经细胞的试剂盒，所述试剂盒包括前期培养液，所述前期培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述前期培养液还包括：

本发明人经过多次改进和尝试，终于发现本发明的前期培养液细胞可以抑制细胞分化过程中细胞的死亡，并且可以促进后续神经细胞的分化比例。DMEM/F12是已经商业化的培养基，在该培养基的基础上加入上述比例的各组分，可以明显提高分化效率，虽然详细的作用机制尚有待研究，但应该与这些组分各自调节的基因、蛋白以及信号通路的相互协同的综合作用相关。

作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述前期培养液还包括：1～3μM TZV或8～12μM Y-27632。其中，Y-27632是一种选择性ROCK1(p160ROCK)抑制剂，TZV是四唑紫(tetrazolium violet)，前期培养液中含有的TZV或Y-27632用于保证待分化细胞的存活率，避免大量细胞死亡。