[发明专利]一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3D共培养模型

说明书

本发明属生物医学领域，涉及一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3D共培养模型。本发明将肿瘤细胞使用绿色荧光蛋白标记，肿瘤相关成纤维细胞使用红色荧光蛋白标记，将两种细胞通过使用制备的甲基纤维素凝胶培养基构建3D共培养模型。本发明制备的3D模型模拟了体内肿瘤的缺氧环境，并通过将肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞共培养构建了体内肿瘤微环境内两种细胞之间相互促进的效果本发明的肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞构成的3D共培养模型不仅模拟了体内肿瘤缺氧的环境，提供了与体内肿瘤微环境类似效果，具有基础研究以及临床药物应用前景。

技术领域

本发明属生物医学领域，涉及一种新型3D共培养模型及其构建方法，具体涉及一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3D共培养模型，该3D共培养模型可用于基础研究以及建立体外药物筛选模型。

背景技术

据报道，逐步增加的癌症发病率和死亡率，已经成为了导致中国人死亡的主要原因，严重威胁中国人的健康。近年来，随着手术技术的逐步进步以及规范化标准化的放化疗的应用，癌症的临床治疗水平已经有了较大的进步，但是例如胰腺癌，非小细胞型肺癌等癌症的五年生存率并没有得到有效的提高。其原因主要是因为临床化疗药物的疗效非常有限。许多临床药物在基础研究阶段均显现出具有强大的体外抑制肿瘤细胞的效果，但是进入临床在作用于病人体内肿瘤时无法发挥出类似的疗效。例如临床治疗晚期胰腺癌的一线药物吉西他滨，在常规二维细胞培养时对胰腺癌细胞系Capan-1，BxPC-3，Panc-1等的IC50均在100nM以下，但是当应用于晚期胰腺癌病人显现出只能部分延缓肿瘤的进展，其中大部分患者只有6个月的中位生存期。类似的情况在肿瘤新药的研发中并不少见，增加了肿瘤患者的经济负担以及生存质量的降低。

研究实践显示，造成药物在基础研究和临床患者效果不一致的原因较多，其中最重要的一点就是现有的常规细胞培养，即2D细胞培养技术培养的细胞和体内肿瘤的微环境不一致。究其原因，体内肿瘤由于增殖迅速，新生血管供血供氧跟不上肿瘤的增殖从而会导致肿瘤部分区域缺氧，继而坏死；同时，体内肿瘤是一个立体的结构，肿瘤的氧气，营养物质离血管越近供应越充足，越远离血管的肿瘤组织则会出现相应的缺氧坏死，而药物在肿瘤组织内的分布梯度也与距离血管的距离有关。目前的研究中的药物筛选模型大部分使用常规细胞培养技术，这种方法使细胞贴壁于组织处理过的培养皿的表面，成为单层贴壁生长，但是由于其不存在体内肿瘤的氧气，营养的梯度从而难以模拟肿瘤的微环境。在2D细胞培养系统，药物直接作用于所有的贴壁细胞，不符合体内肿瘤作为一个立体结构的特点。

药物筛选获得的药物和临床肿瘤患者的疗效不一致还有一个重要原因，那就是以往的药物设计思路大部分均为抑制肿瘤细胞增殖，但是真实的肿瘤微环境内不只有肿瘤细胞。肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)是肿瘤微环境内最重要的非癌组分，近年其和肿瘤细胞的密切关系获得研究者们越来越多的关注。肿瘤细胞可以促进肿瘤相关成纤维细胞的活化，肿瘤相关成纤维细胞可以分泌TGF-β，IL-6，FGF-2等生长因子促进肿瘤细胞的生长，增殖，迁移，同时肿瘤相关成纤维细胞可以发挥屏障的作用使化疗药物的作用降低。两种细胞的这种相互促进作用使得肿瘤细胞难以被化疗药物清除。

3D细胞培养模型是一种体外培养肿瘤细胞使其成为类似于体内的立体结构的一种新型培养模型，逐步受到研究者的重视。3D培养常规2D培养的优势主要在于以下几点：首先，3D细胞培养模型可以形成立体的结构，模拟体内肿瘤的立体结构，同时模拟前文所述的肿瘤内氧气，营养物质的梯度以及缺氧环境；其次，3D细胞培养模型不会有常规2D细胞培养中存在的细胞接触抑制效应，从而更加符合体内肿瘤的生长模型；最后，3D细胞培养模型内的肿瘤细胞分泌的多种细胞因子在体外培养的肿瘤细胞团内可以自由交流，从而模拟体内肿瘤的微环境。由于3D细胞培养模型的种种优势，目前已经开发出了许多不同类型的3D细胞培养模型，如悬滴法(hanging drop)、琼脂-液体覆盖法(soft agar-liquid overlay)、3D多孔支架(porous 3-D scaffold)等。3D细胞培养模型也被越来越多地应用于基础研究，高通量药物筛选等。