[发明专利]血清中25-羟基维生素D的检测方法

权利要求书

1.一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

样品前处理：在血清样品中加入含有25-羟基维生素D内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心，取上清液用乙腈稀释，即得待测样品；所述血清样品与所述乙腈溶液的体积比为1：1-4；所述上清液与所述乙腈的体积比为1：1-4倍；

富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测；

所述富集、分离和检测的步骤包括：先用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化，再将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱，再断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；

其中，富集柱为C6-Phenyl，4×2.0mm，分析柱为C18，100×2.0mm，3μm；流动相1：A相为甲醇，B相为水，流速为1.0-2.0mL/min；流动相2：C相为含0.09-0.11％甲酸的甲醇，D相为含0.09-0.11％甲酸的水，流速为0.2-1.0mL/min；

流动相采用梯度洗脱的模式：0分时，流动相1中A相与B相的体积比为50:50，流动相2中C相与D相的体积比为70:30，用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化；0.25min后将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱，1.5min时流动相2中C相与D相的体积比为85:15；1.9min时断开富集柱与分析柱，用流动相1将富集柱中的残留杂质梯度洗脱至废液瓶中，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测，5.5min时流动相2中C相与D相的体积比为90:10，5.6min时流动相2中C相与D相的体积比为95:5，6.6min时流动相2中C相与D相的体积比为70:30；整个梯度时间为7.0-9.0min。

2.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，二维液相色谱的进样量为30-100μL，柱温为35-50℃。

3.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述流动相1的流速为1.2-1.3mL/min，所述流动相2的流速为0.4-0.6mL/min。

4.根据权利要求1-3任一项所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述25-羟基维生素D内标物为25-羟基维生素D的C¹³标记物或氘代标记物。

5.根据权利要求1-3任一项所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述离心的条件为：温度0-5℃，转速11000-13000r/min，时间4-8min。

6.根据权利要求1-3任一项所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，四级杆质谱条件为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM；

所述正离子模式中，目标定量离子对包括25-羟基维生素D2定量离子对和/或25-羟基维生素D3定量离子对；

目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：25-羟基维生素D2的母离子的质/荷比为413.0-413.8，对应的子离子的质/荷比为394.8-395.5；25-羟基维生素D3的母离子的质/荷比为401.0-401.8，对应的子离子的质/荷比为383.3-383.6。

7.根据权利要求1-3任一项所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件还包括以下离子源参数：电离源为电喷雾电离ESI源，气帘气压力为38-42psi，加热气压力为48-52psi，辅助加热气压力为48-52psi，加热气温度为445-455℃，碰撞气为氮气，碰撞气压力为7.5-8.5psi，电喷雾针电压为5400-5600V。

8.根据权利要求1-3任一项所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件还包括：25-羟基维生素D3定量离子对的去簇电压为104-106V，入口电压为9-11V，碰撞电压为16-18V，出口电压为12-14V；25-羟基维生素D3内标物的定量离子对的去簇电压为114-116V，入口电压为9-11V，碰撞电压为14-15V，出口电压为11-13V；25-羟基维生素D2定量离子对的去簇电压为114-116V，入口电压为9-11V，碰撞电压为14-16V，出口电压为12-14V；25-羟基维生素D2内标物的定量离子对的去簇电压为114-116V，入口电压为9-11V，碰撞电压为14-16V，出口电压为12-14V。