[发明专利]血清中25-羟基维生素D的检测方法

说明书

本发明涉及一种血清中25‑羟基维生素D的检测方法。该方法包括如下步骤：样品前处理：在血清样品中加入含有25‑羟基维生素D内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心，取上清液用乙腈稀释，即得待测样品；所述血清样品与所述乙腈溶液的体积比为1：1‑4；所述上清液与所述乙腈的体积比为1：1‑4倍；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。该方法前处理简单、大大缩短了检测时间，提高了样本的检测通量，检测精度高，成本低廉、特异性、抗基质干扰能力强。

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，特别是涉及一种血清中25-羟基维生素D的检测方法。

背景技术

维生素D是一种脂溶性维生素，是固醇类衍生物，是维持人类身体健康必需的一种化合物。维生素D包括5种化合物，与健康密切相关的是维生素D2和维生素D3。维生素D2和维生素D3经肝脏的单氧化酶(25-羟基氧化酶)氧化形成25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。25-羟基维生素D在血液中的浓度高、循环周期长，因此成为维生素D在人体内的浓度指示剂，是人体维生素D营养状况的评价指标。

维生素D3可由动物性维生素原(7-脱氢胆固醇)经紫外线270-300nm激活形成，维生素D2是由植物性维生素原(麦角固醇)经紫外线270-300nm激活形成的。因此维生素D2多存在于植物性食物中，维生素D3多存在于动物性食物中。维生素D2和D3长期被认为是生物学等价的，然而最近的报道表明这两种形式的维生素D在生物活性和生物利用率上可能具有差异(Armas etc，(2004)J.Clin.Endocrinol.Metab.89:5387-5391)。

人体血液中25-羟基维生素D的浓度较低一般为ppb级别，主要以蛋白DBP结合的形式存在，且人体血液组成复杂存在大量的高亲和力结合蛋白，因此直接检测存在严重的基质干扰，特异性差，灵敏度低等缺点。为了降低基质干扰，提高特异性、灵敏度等，目前常采用方法有：方法1：离线-样本先经蛋白沉淀，再经过液液萃取或者液固萃取后进行氮吹浓缩得到待测样本，样本经高效液相色谱、液相色谱串联质谱等进行检测；方法2：在线-样本先经蛋白沉淀后经过在线萃取装置得到待测物，再经高效液相色谱、液相色谱串联质谱等进行检测。但是这两种方法存在如下的问题：方法1：前处理复杂、处理时间长(一个样本约2小时)、通量低、试剂成本高、对操作人员要求高；方法2：仪器投入大，且在线萃取的耗材成本高。

发明内容

基于此，有必要针对现有技术的上述问题，提供一种血清中25-羟基维生素D的检测方法。该方法前处理简单并能有效去除基质干扰，可以同时快速检测并准确定量25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，灵敏度高、通量高。

具体技术方案如下。

一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，包括以下步骤：

样品前处理：在血清样品中加入含有25-羟基维生素D内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心，取上清液用乙腈稀释，即得待测样品；所述血清样品与所述乙腈溶液的体积比为1：1-4；所述上清液与所述乙腈的体积比为1：1-4倍；

富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。

在其中一些实施例中，所述富集、分离和检测的步骤包括：先用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化，再将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱，再断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；

其中，富集柱为C6-Phenyl(4×2.0mm)，分析柱为C18(100×2.0mm，3μm)；流动相1：A相为甲醇，B相为水，流速为1.0-2.0mL/min；流动相2：C相为含0.09-0.11％甲酸的甲醇，D相为含0.09-0.11％甲酸的水，流速为0.2-1.0mL/min。