[发明专利]利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法

权利要求书

1.利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法，包括以下工艺步骤：

（1）拟南芥根尖的固定：将新鲜拟南芥籽苗迅速放入事先配好的4%多聚甲醛溶液中，室温孵育30min；而后转移至预冷的10%甘油中，放至干燥器中，真空抽气30min；之后放入4℃保存；

（2）拟南芥根尖的冰冻切片：在预先速冻好的样品托上涂一块2~3cm的OCT包埋胶，待胶冻住后用刀片修出一个方形台；将之前固定的根尖依次同向摆放在台子上，迅速用另一层包埋胶盖住根尖；待包埋胶冻住后，再用刀片修块，整体铲下包埋有样品的胶块，确定根尖向外；最后将根尖向外的胶块粘在样品托上以0.3µm的步距切片；

（3）显微镜成像：先使用正置荧光显微镜ImagerA1在低倍镜下挑选出目的切片，再使用共聚焦激光显微镜 LSM 510进行拍照；

（4）Image J图像处理

在Image J中打开连续的纤维切层图像，使用Image → Duplicate…按钮挑选感兴趣的图层，另存为命名后的文件以备后期分析使用；如果感兴趣的是一组图层，则需使用Image → Stacks → Z Project →Projection挑选出相邻的多层图像；

区域相对荧光强度的分析：使用多边形框选按钮框选出感兴趣的目标区域，使用Analysis → Measure 得到此区域的平均荧光强度；如果要测量同一坐标线上各个点的荧光强度，则使用Analysis → Plot Profile 完成；

使用Process → FFT → Bandpass Filter 进行图像的过滤处理，一般将FilterLarge Structure Down to 设定为40；

使用Process → Filters → Gaussian Blur → Sigma设定高斯变换参数，进行数据平滑处理，一般Sigma设为1；

（5）三维细胞结构生物影像显微重组

在Imaris 6.2软件切面视图中打开图像文件，在主工具栏中选择Surpass模式，打开Display Adjustment的高级设置，阈值范围在45-200之间；研究对象在视图区域内显示；

创建一个文件，编辑，改变指针模式为Select，按住Shift键，并点击鼠标在想要的第一个位置上，插入点，移动鼠标至下一个点，按住Shift键，并点击鼠标插入下一个点，如此继续，绘制显微切层上研究区域的轮廓；从上到下，完成所有囊括研究对象的显微切层图像单独多边形的绘制；

使用Calculate Surface计算研究对象的轮廓表面，然后点击Create Surfaces按钮创建表面对象；点击Mask Properties中的Mask All按钮，将其它不感兴趣的表面对象区域掩盖，得到了只有研究对象细胞的三维图像文件；

依照上面的方法将所有感兴趣的细胞进行三维图像重组：依次打开所需的文件遮罩层，点击SnapShot调整位置后进行拍照、录像后进行分析。

2.如权利要求1所述利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法，其特征在于：步骤（3）中，物镜为：Plan-Neofluar×20/0.5、Plan-Neofluar×63/1.4、oilPlan-Neofluar×100/1.4 oil；滤光片设置为：检测DAPI时，激发光405nm，发射光420nm-470nm；检测FITC时，激发光488nm，发射光505nm-555nm；光学切片厚度0.3µm，扫描均值为2，图片以1024×1024格式保存；使用Carl Zeiss AIM软件和Olympus Fluoview Ver.1.6软件进行图像的拍摄和分析。