[发明专利]利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法

说明书

本发明公开了一种利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法，属于细胞结构分析领域。本发明通过对拟南芥根进行横向冰冻切片后，得到仅含有根冠部位的根部横切，10µm的切片厚度大大降低了显微镜Z轴分辨率对成像真实性的影响；通过优化显微拍摄的条件，减小拍摄步进至小于0.4µm，降低Pinhole值以确保计算的光学切片厚度小于0.8µm，保证了画面的细腻程度，扫描范围包含了一个中柱细胞从上至下的全部结构；可以得到更为细致的显微镜成像图片，有效减少了非焦平面杂散光对图像的影响，提高了图像的分辨率，保证了研究对象结构真实性的呈现；利用这种三维图像重组技术，能够更加直观、准确的确定细胞内部内质网结构。

技术领域

本发明涉及一种植物单细胞光学显微整体成像方法，尤其涉及一种植物单细胞三维整体成像方法，属于细胞结构分析领域。

背景技术

拟南芥（Arabidopsis thaliana）又名鼠耳芥，阿拉伯芥，阿拉伯草。属被子植物门，双子叶植物纲，十字花科植物，其基因组大约为12500万碱基对和5对染色体，是目前已知植物基因组中最小的。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。由于有上述这些优点，所以拟南芥是进行遗传学研究的好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”，是一种应用广泛的模式生物，全世界有超过六千家实验室正在对拟南芥的生长发育及其对环境应答的过程开展深入研究。

目前对于拟南芥根尖细胞结构的分析，主要有毛细管电泳、微流控芯片、多种光学显微镜（荧光显微镜、聚焦荧光显微镜、全内反射荧光显微镜、多光子荧光显微镜、荧光相关显微镜、近场扫描光学显微镜等）、扫描电化学显微镜、质谱成像、原子力显微镜、扫描隧道显微镜图像分析、阿达玛变换显微光谱及成像、肿瘤电化学及免疫分析、动力学分析、荧光及发光探针、纳米技术以及实时动态检测等。其中荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。然而，由于拟南芥幼苗的根尖非常细小，一般的根尖细胞显微成像只能直接拿实物在光学显微镜下观察，而且是根的纵向光学切片观察，得到的结果不准确（因为有相邻细胞遮挡的问题）。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法，以提高图像的分辨率，保证研究对象结构真实性的呈现。

本发明利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法，包括以下工艺步骤：

（1）拟南芥根尖的固定：将新鲜拟南芥籽苗迅速放入事先配好的4%多聚甲醛溶液中，室温孵育30min；而后转移至预冷的10%甘油中，放至干燥器中，真空抽气30min；之后放入4℃保存。

（2）拟南芥根尖的冰冻切片：在预先速冻好的样品托上涂一块较厚（2~3cm）的OCT包埋胶，待胶冻住后用刀片修出一个方形台；将之前固定的根尖依次同向摆放在台子上，迅速用另一层包埋胶盖住根尖；待包埋胶冻住后，再用刀片修块，整体铲下包埋有样品的胶块，确定根尖向外；最后将根尖向外的胶块粘在样品托上以0.3µm的步距切片。

（3）显微镜成像：先使用正置荧光显微镜ImagerA1在低倍镜下挑选出目的切片，再使用共聚焦激光显微镜 LSM 510进行拍照。物镜为：Plan-Neofluar×20/0.5、Plan-Neofluar×63/1.4和oilPlan-Neofluar×100/1.4 oil。滤光片设置为：检测DAPI时，激发光405nm，发射光420nm-470nm；检测FITC时，激发光488nm，发射光505nm-555nm。光学切片厚度0.3µm，扫描均值为2，图片以1024×1024格式保存。使用Carl Zeiss AIM软件和OlympusFluoview Ver.1.6软件进行图像的拍摄和分析。

（4）Image J图像处理