[发明专利]一种通过愈伤组织共培养获得斑锦卧牛植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于组培方法领域，具体的说是一种通过愈伤组织共培养获得斑锦卧牛植株的方法。

背景技术

斑锦多肉植物是植物的叶、茎等器官带有不同于植株基本颜色的其他颜色的斑块，这属于植物的一种变异现象(徐民生，1991)。从植物发育学角度来讲，斑锦多肉植物为嵌合体，一般是由同一株植物的少数细胞发生了变异后不断的分裂并和正常细胞共存而形成的，例如常见到兜锦、玉扇锦等(岩鸣,2012)。相比原色来说，斑锦多肉植物主体颜色种类更多，观赏价值更高，其市场价格可翻数倍。

然而，斑锦多肉植物的获得方式主要依赖自然条件或人工繁殖中自发产生的变异，人工诱导研究较少。Binding等(1987)和Chen等(2006)通过原生质体的共培养和细胞嫁接分别获得了茄科和十字花科植物的种间嵌合体植株。可见，通过细胞及组织嫁接的人工诱导合成斑锦多肉植物具有一定的可行性。通过我们对多肉植物多年的组培研究发现，完全锦化的不定芽突变率较高，而斑锦不定芽则较少出现。因此，利用既有的自发产生的锦化卧牛植株的无菌材料来探索斑锦卧牛植株的人工合成方法对于斑锦多肉植物的种质创新具有重要意义。但在此之前还没有关于通过人工合成方法获得斑锦卧牛植株的技术方法，更没有成功的实例。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种通过愈伤组织共培养获得斑锦卧牛植株的方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。该通过愈伤组织共培养获得斑锦卧牛植株的方法主要包括如下步骤：

1)培养基的配制：

(1)基本培养基：MS培养基，其中蔗糖20～30g/L，琼脂6～9g/L，pH＝5.8；

(2)诱导培养基：MS+6-BA 2～6mg/L+NAA 0～0.5mg/L；

(3)分化培养基：MS+6-BA0～0.05mg/L；

(4)增殖培养基：MS+6-BA 0.1～0.3mg/L；

(5)壮苗培养基：MS+NAA 0.05～0.2mg/L；

2)愈伤组织的诱导：选取正常绿色和完全锦化的卧牛无菌苗的叶片为外植体，将其分别切伤后接种到诱导培养基上进行暗培养诱导产生愈伤组织；

3)愈伤组织的增殖：将步骤2)中诱导的愈伤组织转接至新鲜的诱导培养基中在有光条件下进行增殖；

4)愈伤组织的共培养：将步骤3)增殖获得的正常谱系和锦化谱系的愈伤组织在无菌条件下分别切成碎块后混合接种至诱导培养基上进行共培养；

5)不定芽的诱导：挑取步骤4)中呈黄绿色相间或相连的嵌合愈伤块置于分化培养基上进行不定芽的诱导培养；

6)斑锦不定芽的增殖：将步骤5)中分化出的斑锦类型再生不定芽转接至增殖培养基上进行丛生芽的增殖培养；

7)壮苗及移栽：将步骤6)中增殖的斑锦不定芽分割成单株后转接至壮苗培养基上进行壮苗。

进一步地，本发明在所述步骤1)中，所述的培养基包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分具体为：

(1)基本培养基：MS培养基，其中蔗糖30g/L，琼脂8g/L，pH＝5.8；

(2)诱导培养基：MS+6-BA 5mg/L+NAA 0.2mg/L；

(3)分化培养基：MS+6-BA 0.01mg/L；

(4)增殖培养基：MS+6-BA 0.2mg/L；

(5)壮苗培养基：1/2MS+NAA 0.1mg/L；

进一步地，本发明在所述步骤2)中，愈伤组织的诱导培养条件是23±2℃，黑暗；

进一步地，本发明在所述步骤3)中，愈伤组织的共培养是分别将正常谱系(绿色)和锦化谱系(黄色)的愈伤组织在无菌条件下切成大约0.2cm见方的碎块，并将两者混合接种至新鲜的诱导培养基上进行共培养以诱导嵌合愈伤组织的产生；

进一步地，本发明在所述步骤4)中，不定芽的诱导是挑取两谱系嵌合成功的、呈黄绿色相间或相连的愈伤块置于分化培养基上进行不定芽分化；

进一步地，本发明在所述步骤5)中，斑锦不定芽的增殖是将分化出的斑锦类型不定芽转接至增殖培养基上通过诱导丛生芽进一步增殖；

进一步地，本发明在所述步骤3)、4)、5)、6)、7)中，培养条件是温度为23±2℃、光照强度为30～80μmol·m^-2·s^-1、光照时间为8～12小时/天。