[发明专利]一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用

权利要求书

1.一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，

由crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框组成，所述crRNA表达框的核苷酸序列如Seq IDNo.1第107至1716位所示，所述Cpf1核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第1746至7878位所示。

2.根据权利要求1所述的骨干质粒载体，其特征在于，a、所述crRNA表达框包括：水稻U3启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第107至487位所示；壮观霉素抗性基因，其核苷酸序列如Seq ID No.1第495至1701位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1709至1716位所示，

b、所述Cpf1核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1746至3777位所示；LbCpf1编码序列，其核苷酸序列如Seq ID No.1第3786至7607位所示和35s终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第7614至7878位所示。

3.根据权利要求2所述的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体还包括：c、T-DNA的左、右边界序列，其中，所述左边界序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第10127至10150位所示，所述右边界序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第1至25位所示，所述crRNA表达框和所述Cpf1表达框位于所述左边界序列和所述右边界序列之间。

4.根据权利要求1所述的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体还包括潮霉素抗性基因表达框。

5.一种用于水稻目的基因打靶的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，其中所述靶标片段位于所述目的基因上，所述双链靶标片段的一条链具有5’TTTN-(N)_X-3’结构，(N)_X表示数目为X的一条碱基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，TTTN中的N也代表碱基A、G、C、T中的任意一个；

将所述靶标片段整合到权利要求1-4中任意一项所述的骨干质粒载体中，形成带有所述标靶片段的crRNA。

6.根据权利要求5所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：按照靶标序列的核酸排列顺序，分别合成具有5’-GGCA-(N)_X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAA-(N’)_X-3’特征的反向寡核苷酸链，其中正向寡核苷酸链中的(N)_X和反向寡核苷酸中的(N’)_X具有反向互补特征；用BsaI内切酶切开所述骨干质粒载体，将所述正向寡核苷酸链和所述反向寡核苷酸链退火后形成的双链核苷酸替换壮观霉素抗性基因，通过卡那霉素正向选择和壮观霉素负向选择，筛选形成用于水稻目的基因打靶的重组载体。

7.一种通过权利要求6所述方法构建的重组载体在水稻基因打靶中的应用，其特征在于，所述应用包括步骤如下，

将所述重组载体转入水稻细胞，使细胞同时含有针对靶标基因的crRNA和Cpf1核酸酶；在crRNA和Cpf1核酸酶的共同作用下，剪切目的基因的双链靶标片段，诱发所述水稻细胞自身的DNA修复功能，实现目的基因中靶标片段的随机插入和/或随机缺失。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述转入水稻细胞是指将所述重组载体经原生质体瞬时转化或农杆菌介导稳定转化到水稻细胞或组织中，所述应用用于获得在靶标片段上具有随机插入和/或随机缺失的水稻植株。

9.一种获得宿主菌的方法，其特征在于，所述方法包括将通过权利要求5中所述方法获得的重组载体导入目标菌落。