[发明专利]一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用

说明书

本发明公开了一种用于基因工程的骨干质粒载体，所述骨干质粒载体包含crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框，crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框位于同一双元载体中，crRNA表达框由水稻U3启动子，壮观霉素抗性基因和Poly‑T终止子依次构成；LbCpf1核酸酶表达框由ZmUBI启动子，水稻偏好密码子改造后的LbCpf1编码序列和35s终止子依次构成。本发明还提供了利用所述质粒载体构建的含有靶标序列的重组载体，及其在水稻基因打靶中的应用。本发明的骨干质粒载体能够用于进行有效地目标片段的基因打靶，获得带有目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的水稻植株。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种用于植物基因打靶的基因工程载体及在水稻基因改造中的应用。

背景技术

水稻是世界上最主要的作物之一。水稻的产量和品质与国民经济及生活密切相关，持续不断的培育具有更加优良农艺性状的品种对于水稻生产至关重要。与传统育种方法相比，随着生物技术的不断发展，近些年逐渐成熟的基因打靶技术为水稻产量和品质等关键性状的优化提供了便捷和高效的手段。传统的基因打靶方法包括同源重组技术、锌指核酸酶技术(ZFN)、类转录因子激活物技术(TALEN)和CRISPR/Cas9技术，其中同源重组技术在植物中打靶效率极低，而ZFN和TALEN技术都存在基因工程载体构建复杂，周期长，成本高，不适于瞬时转化等技术问题，极大的限制了基因打靶技术在水稻育种改良过程中的实用性。而CRISPR/Cas9技术由于其在靶位点选择上具有一定的局限性，并且其剪切后修复易形成单碱基的缺失或插入，在一定程度上影响了突变体的获得。

近2年发展出的CRISPR/Cpf1技术为基因打靶提供了新手段。CRSIPR/Cpf1系统是存在于细菌中的一种先天性免疫系统。Cpf1能够独自地对crRNA前体进行加工，然后利用成熟的crRNA特异性的识别和剪切DNA。利用这一原理，在真核生物细胞中，通过人工合成带有与Cpf1结合和特异识别靶位点的crRNA，同样可以引导Cpf1切割基因组中的靶点序列，在细胞启动DNA修复机制后，切割位点会出现随机的碱基插入或缺失，从而实现了位点特异性的基因打靶。目前，在大鼠中已成功实现了基因组的CRISPR/Cpf1定向基因打靶。在植物中还没有利用CRISPR/Cpf1系统实现基因打靶的报道。

发明内容

本发明提供了一种用于水稻基因打靶的基因工程骨干载体。

具体而言，一方面，本发明提供了一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，

包含crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框，所述crRNA表达框的核苷酸序列如Seq IDNo.1第107至1716位所示，所述Cpf1核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第1746至7878位所示。

优选地，在所述骨干质粒载体中，a、所述crRNA表达框包括：水稻U3启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第107至487位所示；壮观霉素抗性基因(SpR)，其核苷酸序列如SeqID No.1第495至1701位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1709至1716位所示，

b、所述Cpf1核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1746至3777位所示；水稻偏好密码子改造后的Cpf1编码序列，其核苷酸序列如Seq IDNo.1第3786至7607位所示和35s终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第7614至7878位所示。

优选地，所述骨干质粒载体还包括：c、T-DNA的左、右边界序列，其中，所述左边界序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第10127至10150位所示，所述右边界序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第1至25位所示，所述crRNA表达框和所述Cpf1表达框位于所述左边界序列和所述右边界序列之间。