[发明专利]一种含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液及应用

权利要求书

1.一种含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液，其特征在于：此培养液在基础培养液的基础上，添加了肝脱细胞基质溶液，并补充了胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、地塞米松及胎牛血清；

所述基础培养液为DMEM培养液、F12培养液、DMEM/F12培养液、MEM培养液中的一种或二种以上的混合液；

所述培养液中肝脱细胞基质溶液的浓度为5-30％(v/v)；

所述培养液中胰岛素的浓度为5-100μg/L；

所述培养液中转铁蛋白的浓度为1-10mg/L；

所述培养液中亚硒酸钠的浓度为2-10μg/L；

所述培养液中地塞米松的浓度为0.1-10μg/L；

所述培养液中胎牛血清的浓度为5-20％(v/v)。

2.按照权利要求1所述的肝细胞培养液，其特征在于：

所述肝脱细胞基质溶液为动物肝脏经过加工制成；所述肝脱细胞基质溶液的制备包括以下两个过程：

(1)肝脱细胞基质颗粒的制备：取健康动物的完整肝叶冻存于-70至-80℃；冷冻24-48h后用切片机将肝叶切成3-5mm厚的肝组织片，将肝组织片与脱细胞液按1/10-1/20(w/v，g/ml)比例混合置于恒温摇床振摇(0-4℃，100-200转/分)去除肝细胞，脱细胞液成分以及处理时间依次为：双蒸水、72h；1％(v/v)Triton X-100和0.1％(v/v)氨水溶液、48h；0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、24h；双蒸水、72h。处理后的肝脱细胞组织片在-70至-80℃冷冻后，经液氮研磨仪粉碎为粒径500-1000μm大小颗粒后冷冻干燥；

(2)肝脱细胞基质颗粒的溶液化：将冷冻干燥后的肝脱细胞颗粒与1mg/mL胃蛋白酶溶液(溶剂为0.1mol/L盐酸)按10mg：1mL比例混合，经搅拌36-72h(20-25℃，400-600转/分)，离心10-30min(0-4℃，8000-12000转/分)后取上清，加入1-4mol/L氢氧化钠溶液调节上清pH至8.4-8.6永久灭活胃蛋白酶后，离心20-60min(0-4℃，12000-14000转/分)后取上清，上清溶液再依次经0.8μm、0.45μm以及0.22μm无菌滤膜过滤，透过滤膜的滤液置于0-4℃保存。

3.按照权利要求2所述的肝细胞培养液，其特征在于：

所述动物包括猪、牛、猴、兔、狗、猫、小鼠、大鼠中的一种或二种以上。

4.一种权利要求1-3任一所述肝细胞培养液的应用，其特征在于：此培养液用于肝细胞的体外培养。

5.按照权利要求4所述肝细胞培养液的应用，其特征在于：所述肝细胞包括人和/或哺乳动物来源的原代肝细胞、永生化肝细胞株、干细胞来源肝细胞或肝细胞聚集体中的一种或二种以上；哺乳动物为猪、牛、猴、兔、狗、猫、小鼠、大鼠中的一种或二种以上。