[发明专利]美洲大蠊wingless基因全长鉴定及应用

权利要求书

1.一种美洲大蠊wingless基因全长cDNA，其特征在于，该基因序列GenBank数据库登录号为KJ680328；所述的cDNA全长序列共1,456bp，其开放阅读框包含1,194个核苷酸，编码397个氨基酸，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述的基因序列编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

3.一种如权利要求1所述的美洲大蠊wingless基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)对从美洲大蠊样本中提取的总RNA进行反转录制备cDNA；

2)以步骤1)中获得的cDNA为模板，简并如SEQ ID NO.3所示的引物F1和如SEQ ID NO.4所示的R1为上游引物和下游引物，进行PCR扩增；

3)在对步骤2)中扩增所得的PCR产物进行回收、连接、转化，以及鉴定和测序；

4)将步骤1)中所获得的RNA作为模板，构建RACE cDNA文库；获得的产物为5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA，可分别作为5'-RACE和3'-RACE反应的模板；

5)根据步骤3)中所获得的基因序列设计3'RACE和5'RACE引物，分别以步骤4)中所获得的5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA为模板，并使用UPM引物，其核苷酸序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，进行5'-RACE或3'-RACE巢式PCR扩增美洲大蠊wingless基因的全长序列；

所述的3'-RACE和5'-RACE引物的核苷酸序列分别为：

3’RACE-F1：如SEQ ID NO.5所示；

3’RACE-F2：如SEQ ID NO.6所示；

5’RACE-R1：如SEQ ID NO.7所示；

5’RACE-R2：如SEQ ID NO.8所示；

6)回收、连接和转化步骤5)中扩增所得的第一次巢式PCR的5’RACE和3’RACE的PCR产物；

7)将步骤3)中获得的wingless基因序列与步骤6)中获得的5’RACE基因序列进行拼接，根据拼接好的基因序列设计第二次巢式PCR的5'RACE引物，并以步骤4)中所获得的5'-RACE-Ready cDNA为模板，第二次巢式PCR扩增美洲大蠊wingless基因的全长序列；所述的第二次巢式PCR的5'-RACE引物的核苷酸序列分别为：

5’RACE-R3：如SEQ ID NO.9所示；

5’RACE-R4：如SEQ ID NO.10所示。

8)在对步骤7)中扩增所得的第二次巢式PCR的5’RACE的PCR产物进行回收、连接、转化，以及鉴定和测序；

9)将步骤3)中获得的wingless基因序列，步骤6)中获得的5’RACE和3’RACE基因序列与步骤8)中获得的5’RACE基因序列进行拼接，得到wingless基因全长序列，经BLAST比对验证其为美洲大蠊wingless基因全长cDNA序列。

4.如权利要求3所述的一种如权利要求1所述的美洲大蠊wingless基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，步骤2)中，其PCR反应条件如下：94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35cycles；72℃10min；4℃保存。

5.如权利要求4所述的一种如权利要求1所述的美洲大蠊wingless基因全长cDNA的克隆方法，其特征在于，步骤5)中，第一轮PCR反应条件为：94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，65℃30s，72℃3min，15个循环；72℃10min；4℃保存；优选地，第二轮PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃2min，20个循环；72℃10min；4℃保存。