[发明专利]一种检测细胞衰老的方法

权利要求书

1.一种检测细胞衰老的方法，将染料食品红104(英文名Phloxin B，CAS：18472-87-2)结合到待检测裂殖酵母细胞中，形成细胞--染料复合物，加以检测。包括以下步骤：

a)染料储液制备：

将染料Phloxin B固体粉末配制成1mg/ml的储液；

b)细胞培养：

将待检测的裂殖酵母菌株活化后，接种于2.5ml YES液体培养基中，制备饱和过夜培养液，测定其OD600，取一定菌液稀释到装有新鲜YES液体培养基的三角瓶中，使其起始浓度为1×105cells/ml，即A600＝0.01，30℃恒温培养，摇床转速220rpm；

c)细胞--染料复合物制备：

在一定时间点测定细胞存活率，取菌液测定其OD600，取0.5OD600的菌液，离心，用无菌水洗涤细胞一次，加入Phloxin B，避光染色细胞2h；

d)细胞--染料复合物检测：

用PBS洗涤细胞3次后，将细胞置于载玻片上，荧光显微镜下检测细胞存活率。

2.根据权利要求1所述之检测细胞寿命的新方法，其特征在于，所述a)步骤包含如下具体工艺：

从泰坦科技股份有限公司购买进口分装染料Phloxin B固体粉末，包装为5G/瓶，品牌Acros，取20mg加入到20ml双蒸馏水中，充分溶解混匀，配制成1mg/ml的储液，储液呈红色；

b)步骤包含如下具体工艺：

从-80℃低温冰箱中取出所需的裂殖酵母菌株，接种于YES平板中，30℃培养2-3天，(附：YES培养基成分为：葡萄糖30g/L；酵母提取物5g/L；组氨酸，丝氨酸，亮氨酸，尿嘧啶，腺嘌呤各225mg/L，YES固体平板需加20g/L琼脂，YES液体培养基不加琼脂)；挑取3-4个菌落于装有2.5ml YES的带棉塞的大号试管中培养过夜(大号试管型号为20mm×20cm)；稀释饱和过夜培养液到盛有25ml已灭菌的YES液体培养基的150ml三角瓶中，保证起始浓度为1×105cells/ml，即起始OD600＝0.01；2天后(即培养48h后)记为CLS Day1(CLS Day1存活率定义为100％)，开始检测存活率；

c)步骤包含如下具体工艺：

在超净工作台中，取已灭菌1.5ml EP管加入900ul无菌水，再从三角瓶中用移液器吸出100ul细胞培养液于900ul无菌水中，即将培养液稀释10倍，用分光光度计测定稀释后的菌液OD600，取0.5OD600的菌液5000rpm离心3min获得细胞，用无菌水洗涤细胞一次后加入1ml无菌水，加入1mg/ml的Phloxin B储液，使其终浓度为5μg/ml；于30℃摇床避光温育染色2h；

d)步骤包含如下具体工艺：

用1×PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，100mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)将细胞洗涤3次，将细胞混匀后用移液器吸取7μl于载玻片上，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下，荧光显微镜型号OLYMPOSIX71，于绿色激发光下激发红色荧光，拍照，红色细胞即为死细胞。同时在白色光场视野下拍照，白色光场下的细胞为总细胞数，包含死活细胞，统计死活细胞比例，得出存活率。