[发明专利]一种DNA序列编辑的方法

权利要求书

1.一种DNA序列编辑方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

提供第一DNA重组片段，所述第一DNA重组片段具有第一筛选标记，和供酶切割的切割位点，通过同源重组将所述第一DNA重组片段整合入所述DNA序列待编辑位点的一侧；

提供第二DNA重组片段，所述第二DNA重组片段具有与所述第一DNA重组片段中的所述切割位点两侧序列同源的同源臂；

酶切割整合入所述DNA序列的所述第一DNA重组片段，在所述切割位点形成切口，通过同源重组将所述第二DNA重组片段整合入待编辑DNA序列中，从而实现所述DNA序列编辑。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的“将所述第一DNA重组片段整合入所述DNA序列待编辑位点的一侧”和“将所述第二DNA重组片段整合入待编辑DNA序列中”中的“整合”分别包括替换目标DNA序列的一段序列或向目标DNA序列中插入一段外源的DNA序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二DNA重组片段中包括替代序列，通过同源重组将待编辑位点替换为所述替代序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)在待编辑DNA序列内设定第一识别位点

所述第一识别位点位于待编辑位点的一侧；

(2)提供第一DNA重组片段

所述第一DNA重组片段具有第一筛选标记，第二识别位点和位于所述第一筛选标记两侧的同源臂，所述同源臂与所述第一识别位点两侧的序列同源；

(3)第一次同源重组

在所述第一识别位点切开待编辑DNA序列，通过同源重组将所述第一DNA重组片段整合入待编辑位点的一侧；

(4)提供第二DNA重组片段

所述第二DNA重组片段具有与所述第二识别位点两侧序列同源的同源臂；

(5)第二次同源重组

在所述第二识别位点切开DNA序列，通过同源重组将所述第二DNA重组片段整合入待编辑DNA序列中，从而实现所述DNA序列编辑。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二DNA重组片段中包括替代序列，在步骤(5)中通过第二次同源重组，将所述待编辑位点替换为所述替代序列。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二识别位点位于所述第一筛选标记内。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中通过第二次同源重组去除第一次同源重组中整合入的外源DNA序列。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述DNA序列编辑方法为对基因组特定位点进行编辑的方法。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述同源臂的长度为40bp-1000bp。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一识别位点和所述第二识别位点分别独立地选自：酶切位点、CRISPR系统切割位点、TALEN切割位点、ZFN切割位点、Argonaute切割位点中的任意一种或几种。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的酶切位点为归位核酸内切酶酶切位点。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的归位核酸内切酶酶切位点为I-SceI酶切位点或I-CeuI酶切位点。

13.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一识别位点和所述第二识别位点分别为不同的CRISPR系统所对应的切割位点。