[发明专利]一种DNA序列编辑的方法

说明书

本发明提供了一种DNA序列编辑的方法，具体地本发明的方法采用两步替换法来进行DNA序列编辑，其中第一步为替换目标位点附近的一段序列(或为插入一段外源的DNA序列)，第二步将替换(或插入)的外源DNA序列切开，筛选外源DNA重组片段与基因组进行DNA重组之后得到的细胞，从而上述目标位点附近的序列替换为目标序列。结合CRISPR技术或其它技术，本发明可以高效、快速地进行染色体任意位点，并且可以进行任何形式的突变(包括突变、删除、插入外源DNA序列)等。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地本发明涉及一种DNA序列编辑的方法，尤其涉及一种能够快速、高效进行基因组定点突变、删除和定点插入外源DNA序列的方法。

背景技术

基因组编辑是指在基因组上进行特定位点的突变、敲入、删除等。该技术不仅在科研领域受到了极大重视，而且在农业和医疗领域的潜力也备受关注。具体的应用包括：(1)构建模式动物，帮助科学研究；(2)改造植物的性状，提高作物产量和逆境耐受能力等；(3)检测和改造人的基因，达到精准医疗的目的等。

得益于宿主自身的同源重组，科学家能够对基因组DNA进行基因敲除、外源DNA插入等实验。然而，由于同源重组的效率比较低，需要引入筛选标记(如抗性基因DNA序列等)以用于后续的筛选，从而实现基因敲除和DNA插入的目的。到了2000年，Barry L.Wanner实验室开发了Red重组系统，大大提高了DNA重组的效率，也降低了对重组的DNA同源臂长度的要求(只需要36-50nt的同源序列即可)(Kirill A.Datsenko and Barry L.Wanner(2000).One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.PNAS,97,6640-6645)。尽管如此，进行基因组编辑时，还是需要引入抗性基因等筛选标记以用于阳性克隆的筛选。为了去除阳性克隆内的筛选标记序列，需要在筛选标记序列两端加入FRT等重组位点，并通过引入Flp重组酶来介导两个FRT位点间进行位点特异性重组，以删除两个FRT位点间的筛选标记序列。类似的位点特异性重组系统还包括Cre重组酶和LoxP重组位点等。这类技术虽然可以成功消除筛选标记序列，但是会留下一个FRT重组位点(或其它类似重组位点)，无法实现基因组无痕编辑(如定点突变等)的需求。

然而，要在哺乳动物细胞的基因组上进行定点编辑等实验仍然比较麻烦，而且效率很低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA序列编辑的方法及适用该方法的试剂盒。

本发明的第一方面，提供了一种DNA序列编辑方法，所述方法包括步骤：

提供第一DNA重组片段，所述第一DNA重组片段具有第一筛选标记，和供酶切割的切割位点，通过同源重组将所述第一DNA重组片段整合入所述DNA序列待编辑位点的一侧；

提供第二DNA重组片段，所述第二DNA重组片段具有与所述第一DNA重组片段中的所述切割位点两侧序列同源的同源臂；

酶切割整合入所述DNA序列的所述第一DNA重组片段，在所述切割位点形成切口，通过同源重组将所述第二DNA重组片段整合入待编辑DNA序列中，从而实现所述DNA序列编辑。

在另一优选例中，所述“整合”包括替换目标DNA序列的一段序列或向目标DNA序列中插入一段外源的DNA序列。

在另一优选例中，所述第二DNA重组片段中包括替代序列，通过同源重组将待编辑位点替换为所述替代序列。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(1)在待编辑DNA序列内设定第一识别位点

所述第一识别位点位于待编辑位点附近的一侧或该位点上；

(2)提供第一DNA重组片段