[发明专利]体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法、试剂盒以及肿瘤疫苗有效
申请号: | 201611022501.5 | 申请日: | 2016-11-15 |
公开(公告)号: | CN106645677B | 公开(公告)日: | 2019-08-09 |
发明(设计)人: | 韩研妍;梁小玲;陈锡和;马民骏;唐龙清;周向军 | 申请(专利权)人: | 恒瑞源正(上海)生物科技有限公司;恒瑞源正(广州)生物科技有限公司 |
主分类号: | G01N33/53 | 分类号: | G01N33/53;G01N33/50;A61K39/00;A61P35/00 |
代理公司: | 深圳市顺天达专利商标代理有限公司 44217 | 代理人: | 邹秋菊 |
地址: | 200135 上海市浦东新区中国(上海*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 抗原特异性 肿瘤 体外检测 肿瘤疫苗 试剂盒 检测 酶联免疫 斑点法 外周血单个核细胞 肿瘤免疫治疗 细胞培养液 抗原刺激 抗原 孵育 扩增 种体 制作 | ||
1.一种非诊断目的的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法,其特征在于,包括:
S1、在外周血单个核细胞的细胞培养液中加入肿瘤新生抗原刺激并进行培养孵育;
S2、采用IFNγ酶联免疫斑点法检测识别所述肿瘤新生抗原的肿瘤新生抗原特异性T细胞;
其中所述肿瘤新生抗原包括序列为LSKENSLIIQFTSFVAV的抗原肽和序列为KLVVVGAAGVGKSAL的抗原肽。
2.根据权利要求1所述的非诊断目的的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤S1包括:
S11、采用抗原预测软件netMHC4设计所述肿瘤新生抗原;
S12、在悬浮所述外周血单个核细胞的细胞培养液中加入所述肿瘤新生抗原进行预刺激并进行培养。
3.根据权利要求2所述的非诊断目的的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤S11包括:
S111、取离体肿瘤组织做基因分析,以找出非同义的基因突变位点;
S112、采用抗原预测软件netMHC4基于包含所述非同义基因突变位点的抗原与相应的主要组织相容性分子的结合能力选择结合能力最好的抗原肽序列;
S113、采用抗原预测软件netMHC4从所述抗原肽序列中选择出其与相应的主要组织相容性分子的结合能力明显高于其对应的非基因突变位点与相应的主要组织相容性分子的结合能力的抗原肽序列作为所述肿瘤新生抗原。
4.根据权利要求2所述的非诊断目的的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤S12包括:
S121、将所述外周血单个核细胞在无血清细胞培养液中悬浮,并加入所述肿瘤新生抗原进行预刺激;
S122、在常温含CO2的培养箱中进行培养。
5.根据权利要求4所述的非诊断目的的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤S2包括
S21、将预刺激后的所述外周血单个核细胞转移到包被有IFNγ抗体的容器内,加入所述肿瘤新生抗原进行孵育,从而使得受到所述肿瘤新生抗原刺激后的肿瘤新生抗原特异性T细胞分泌IFNγ;
S22、所述IFNγ抗体捕获所述IFNγ,且通过酶联反应产生新生肉眼可见的免疫斑点;
S23、统计所述免疫斑点的数量,以基于所述免疫斑点的数量检测所述肿瘤新生抗原特异性T细胞的数量。
6.根据权利要求5所述的非诊断目的的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤S21进一步包括:
S211、采用乙醇水溶液在常温下润湿Elispot板,随后采用PBS清洗所述Elispot板;
S212、加IFNγ抗体以包被所述Elispot板,然后加板盖低温孵育过夜,随后用PBS清洗后加封闭液封闭所述IFNγ抗体未结合的位置,加板盖常温孵育;
S213、调整所述无血清细胞培养液中的预刺激后的所述外周血单个核细胞的浓度后,随后加入相应的所述肿瘤新生抗原形成混合无血清细胞培养液;
S214、将所述混合无血清细胞培养液加入到包被好的所述Elispot板的板孔中,加盖板在常温含CO2的培养箱中进行培养。
7.根据权利要求6所述的非诊断目的的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法,其特征在于,所述步骤S22进一步包括:
S221、弃除所述无血清细胞培养液,然后采用PBS进行清洗,随后采用清洗液进行清洗;
S222、随后加入生物素偶联的IFNγ识别抗体,常温孵育;
S223、采用清洗液进行清洗,然后加入偶联链酶亲和素的辣根过氧化物酶,加板盖进行常温孵育;
S224、采用清洗液进行清洗,然后加入辣根过氧化物酶的底物,室温避光,然后采用清洗液充分清洗,晾干。
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