[发明专利]体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法、试剂盒以及肿瘤疫苗

说明书

本发明涉及一种体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法、试剂盒以及肿瘤疫苗。所述体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，包括：S1、在外周血单个核细胞的细胞培养液中加入肿瘤新生抗原刺激并进行培养孵育；S2、采用IFNγ酶联免疫斑点法检测识别所述肿瘤新生抗原的肿瘤新生抗原特异性T细胞。实施本发明的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法和试剂盒，通过IFNγ酶联免疫斑点法可以高精度地检测出肿瘤新生抗原特异性T细胞，且检测方法简单、结果明确、成本低廉。实施本发明的肿瘤疫苗，可以有效扩增肿瘤新生抗原特异性T细胞，进而有效用于肿瘤免疫治疗药物的制作。

技术领域

本发明涉及分子免疫学和细胞免疫学领域，更具体地说，涉及一种体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法、试剂盒，以及肿瘤疫苗。

背景技术

T细胞通过T细胞表面免疫受体特异性识别肿瘤细胞的主要组织相容性分子(Major histocompatibility complex，MHC)递呈的抗原肽段(即抗原表位)来杀死或者杀伤癌细胞。CD8+细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)能特异性识别靶细胞分泌重要的细胞因子干扰素γ(Interferonγ,IFNγ)，并直接杀伤癌细胞。CD4+辅助T细胞识别肿瘤抗原表位后能分泌多种细胞因子包括IFNγ、IL2、IL4和TNFα，激活CD8+CTL识别并杀伤肿瘤细胞。目前找寻合适的肿瘤细胞特有靶点，即肿瘤抗原，以及扩增特异性识别肿瘤抗原的免疫细胞是肿瘤免疫治疗技术的关键技术。目前大部分细胞免疫治疗选择的靶点是肿瘤细胞过表达抗原，即在肿瘤细胞中的表达远远高于正常细胞。肿瘤新生抗原是区分肿瘤细胞和正常细胞的特异性靶点，是肿瘤免疫细胞治疗的最佳靶点。

检测特异性识别肿瘤新生抗原的T细胞可以使用MHC-肽多聚体染色(比如ProImmune的五聚体，Beckman coulter的四聚体以及Immundex公司的dextramer)。外周血中新生抗原特异性的T细胞能结合MHC-肿瘤新生抗原肽的多聚体，偶联在多聚体上的荧光分子在激光激活下会发出荧光，所以结合了MHC-肽多聚体的肿瘤新生抗原肽多聚体的特异性T细胞可以被细胞流式仪检测到，用来分析病人外周血中识别肿瘤新生抗原肽的T细胞数量和比率。

然而，使用MHC-肽多聚体流式细胞分析方法检测肿瘤新生抗原特异性T细胞识别主要有以下几个缺点：

1)不确定性高：肿瘤新生抗原的长度以及递呈它对应的MHC分子都具有不确定性，因此可能无法产生稳定的MHC-新生肽的多聚体；

2)敏感度低：MHC-肽多聚体流式细胞分析方法能有效检测的特异性T细胞比率是0.001％，当低于这个数值时，将无法被检测；

3)功能缺失：MHC-肽多聚体流式细胞分析方法只能展现特异性T细胞能特异性地结合MHC-肽复合体，但不能检测到T细胞识别抗原肽后是否能有效被刺激，分泌功能性细胞因子或者杀伤肿瘤细胞；

4)费用高：每一个抗原肽需要由特定的MHC分子递呈而被T细胞识别，因此检测费用高。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种确定性强、敏感度高、功能全面且费用低廉的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法和试剂盒，以及可以用于扩增肿瘤新生抗原特异性T细胞的肿瘤疫苗。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，包括：

S1、在外周血单个核细胞的细胞培养液中加入肿瘤新生抗原刺激并进行培养孵育；

S2、采用IFNγ酶联免疫斑点法检测识别所述肿瘤新生抗原的肿瘤新生抗原特异性T细胞。

在本发明所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法中，所述步骤S1包括：

S11、采用抗原预测软件netMHC4设计所述肿瘤新生抗原；