[发明专利]面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法

权利要求书

1.一种面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，其特征在于，包括步骤：

a.确定色谱条件，色谱条件为UltimateXBC18色谱柱，色谱柱为250mm×4.6mm,5μm；柱温：30℃；流动相：水-甲醇，梯度洗脱，0-60min，甲醇：20％-100％；DAD检测器波长范围200-600nm，检测波长440nm，流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；

b.制备对照品溶液：

混合对照品溶液：精密称取西红花苷-Ⅰ对照品和西红花苷-Ⅱ对照品，置于棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得混合对照品溶液，摇匀，备用；

西红花苷-Ⅰ对照品溶液：精密称取西红花苷-Ⅰ对照品置棕色量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，得西红花苷-Ⅰ对照品溶液；

c.制备供试品溶液：参照中国药典2015年版西红花项下，称取西红花样品粉末约10mg，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加稀乙醇40mL，冰浴超声：250W、40KHz处理20min，放置室温，加乙醇定容至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液；

d.根据2015年版中国药典的外标法定量西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量；

e.一测多评法QMSA测定西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含量；

f.紫外分光光度法测定总西红花苷的含量；

g.面积归一化法测定总西红花苷的含量，精密吸取供试品溶液及步骤b中对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪测定，测定时间为不少于60分钟，同时进行质谱分析，质谱条件为：离子源：大气压电喷雾离子源；检测模式：正负离子；全扫描质核比：50-1200 m/z；干燥气温度：350℃，干燥气流量：12.0L·min-1，雾化气压力：35.0psi；毛细管电压：4.5kV；碰撞电压1.0V；进入质谱的流动相流速分流至0.4mL·min-1，以西红花苷-Ⅰ为对照，按C总苷＝(C苷-Ⅰ×A总苷)/A苷-Ⅰ计算总西红花苷的含量，

其中A苷-Ⅰ为样品中西红花苷-Ⅰ色谱峰峰面积；A总苷为西红花样品440nm下12个西红花苷类色谱峰峰面积之和；C苷-Ⅰ为外标法测定的西红花样品中西红花苷-Ⅰ的质量浓度；C总苷为西红花样品中总西红花苷质量浓度。

2.如权利要求1所述的面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤d，进一步为，取步骤b中西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的混合对照品溶液1、2、4、8、10、20μL，按步骤a中色谱条件进样分析，测定峰面积，分别以西红花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ质量浓度对其相应峰面积进行线性回归，得回归方程，精密量取步骤c中的供试品溶液10μL，注入液相色谱仪测定，相应峰面积代入回归方程计算苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含量。

3.如权利要求1所述的面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤e，进一步为，取步骤b中混合对照品溶液，分别进样1、2、4、8、10、15、20μL，记录峰面积，应用多点校正法，以西红花苷-Ⅰ为内参物，计算西红花苷-Ⅰ对西红花苷-Ⅱ的相对校正因子fk/s，fk/s计算公式：fk/s＝(Cs×Ak)/(Ck×As)，待测成分西红花苷-Ⅱ质量浓度计算公式：Ck′＝(Cs×Ak′)/(fk/s×As)，

其中Cs为内参物西红花苷-Ⅰ质量浓度，As为内参物色谱峰峰面积，Ck为西红花苷-Ⅱ对照品质量浓度，Ak为西红花苷-Ⅱ对照品色谱峰峰面积，Ck′为西红花样品中西红花苷-Ⅱ质量浓度，Ak′为西红花样品中西红花苷-Ⅱ色谱峰峰面积。

4.如权利要求1所述的面积归一化法测定西红花药材中西红花苷类成分的方法，其特征在于，所述步骤f，进一步为，精密吸取西红花苷-Ⅰ对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL置于10mL量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，以稀乙醇作空白对照，采用紫外-可见分光光度法，于440nm波长处测定吸光度，得标准曲线；精密吸取步骤c中的供试品溶液5mL，置50mL棕色量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，用可见分光光度法于440nm波长处测定吸光度，以西红花苷-Ⅰ为对照标准品，按标准曲线计算总西红花苷含量。