[发明专利]一种小鼠小肠巨噬细胞分离及培养方法

说明书

本发明提供一种小鼠小肠巨噬细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，酒精消毒后迅速取出小肠，预冷PBS冲洗肠腔至流出液变清；(b)小肠纵向剖开，加入EDTA震荡温育；(c)静置弃上清，加入混合酶液消化；(d)连续筛网过滤；(e)滤液经Ficoll分离，清洗2‑3次；(f)完全混合培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中；(g)差速贴壁法获得小肠巨噬细胞。本发明提供了一种简单、高效、稳定的分离高活性、高纯度的小肠巨噬细胞的方法。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种小鼠小肠巨噬细胞分离及培养方法。

背景技术

髓样祖细胞分化的单核细胞迁移到血液中，循环若干天后，分布于肠组织，成为定居的巨噬细胞，即肠道巨噬细胞，主要存在于肠粘膜的派氏集合淋巴结(PP)中，是调节肠道免疫反应的主要细胞之一，能够吞噬病原微生物、抵抗免疫刺激物，在固有免疫应答中发挥重要作用，是机体第一道防御机制的基础。

发明内容

本发明的目的是建立一种简单、高效、稳定的分离小肠巨噬细胞的方法。

为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法获得小鼠小肠巨噬细胞：

本发明提供一种小鼠小肠巨噬细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，酒精消毒后迅速取出小肠，预冷PBS冲洗肠腔至流出液变清；(b)小肠纵向剖开，加入EDTA震荡温育；(c)静置弃上清，加入混合酶液消化；(d)连续筛网过滤；(e)滤液经Ficoll分离，清洗2-3次；(f)完全混合培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中；(g)差速贴壁法获得小肠巨噬细胞。

可选的小鼠为6-8周龄，体重22-28g的雌性小鼠。

可选的EDTA的浓度为0.1％-0.15％。

可选的震荡消化的时间45min-1h。

可选的混合酶液为1.5-2％胶原酶IA、2％-2.5％的IV型胶原酶和1.5％-2.5％的II型胶原酶和0.1％-0.15％的透明质酸酶，消化时间为50min-1h。

可选的连续筛网过滤的方法为，消化后的组织液依次经过100目、200目、400目筛网过滤。

可选的混合完全培养基为含5％FBS和5％FCS的DMEM/1640(1∶1)。

可选的差速贴壁的方法为混合完全培养基重悬接种后，培养2-4h后更换新鲜完全培养基。

本发明提供一种连续消化法结合差速贴壁法获得小鼠小肠巨噬细胞的方法，操作简便，耗时短。

附图说明

图1培养72h细胞图片(200×)

具体实施方式

为了使本发明的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。

本发明选择6-8周龄，体重22-28g的雌性小鼠，分离小肠巨噬细胞。具体操作如下：

1、脱颈的方法处死小鼠，75％酒精消毒，剪开腹部皮肤及腹膜，取出小肠，用含双抗预冷的PBS冲洗小肠内容物至流出液变清；

2、将小肠纵向剖开，加入37℃预热的含0.1％-0.15％EDTA的PBS缓冲液中，37℃水浴锅中振荡温育45min-1h；

3、弃上清，剩余组织块用混合消化酶，于37℃摇床水浴锅中消化50min-1h，每15-20min吹打混匀一次，所述混合消化酶液为含1.5-2％胶原酶IA、2％-2.5％的IV型胶原酶和1.5％-2.5％的II型胶原酶和0.2％-0.25％的透明质酸酶；