[发明专利]一株GRA17基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法

权利要求书

1.一株GRA17基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株，其特征在于，所述的GRA17基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株为LZ△GRA17，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201656。

2.根据权利要求1所述的一株GRA17基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A）pSAG1::Cas9-U6:: sg GRA17质粒构建：

1）利用网页软件设计GRA17的sgRNA为GACTGTCCCTGAGGACCCAT；

2）利用Q5定点突变试剂盒和扩增引物将GRA17的sgRNA替换pSAG1::Cas9-U6:: sgUPRT载体中的sgUPRT构建成pSAG1::Cas9-U6:: sg GRA17，扩增引物为gRNA-Fw: GACTGTCCCTGAGGACCCATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC和gRNA-Rv: AACTTGACATCCCCATTTAC；

3）PCR条件为:以pSAG1::Cas9-U6:: sgUPRT为模板，利用引物gRNA-Fw和gRNA-Rv进行pSAG1::Cas9-U6:: sgGRA17载体的PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性 1min， 55℃复性1min；72℃延伸 5min；25个循环；

4）KLD反应：反应体系为PCR产物1μl，2X KLD Reaction Buffer 5μl，10X KLD Enzyme mix 1μl，ddH₂O 3μl；在室温25度下反应5分钟；

5）转化：将上述KLD反应产物转化到大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落，提取质粒，测序鉴定；测序正确的标记为pSAG1::Cas9-U6:: sgGRA17；

B）质粒大提：

1）挑取含pSAG1::Cas9-U6:: sgGRA17质粒的阳性菌液于含1000U/mL Amp+的LB固体选择培养基上划线，37℃培养过夜，挑取板上的一个单菌落置于4 mL LB液体选择培养基中，摇床37℃，180～220rpm培养12～16h，将上述培养菌液以1：100的比例接种到装有100mL LB培养基的500mL锥形瓶中，摇床37℃，180～220rpm培养过夜；

2）将细菌培养物置于冰中或4℃冰箱数分钟，4℃，9500rpm离心5min，收集细菌培养物沉淀，弃上清，倒置离心管使上清尽量流出，10mL预冷的Solution I重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在Solution I中完全分散；

3）加入20mL新配制的Solution II，轻摇并上下颠倒混匀3～5次，再加入15mL预冷的Solution III，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀，冰上或-20℃冰箱放置10min，加Solution II和Solution III的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解；4℃或室温，11000rpm离心10min，利用5层纱布将上清过滤，转移到两个新50mL离心管中；

4）上清与0.6倍体积异丙醇混匀，室温放置10min；室温下，11000rpm离心10min，弃上清，将空管倒置于滤纸上3-5分钟，除去残余，加入3mL ddH₂O充分溶解，再加入3mL预冷的5M LiCl溶液，充分混匀，两只离心管合并为一管，冰中或-20℃冰箱放置10min；4℃或室温，11000rpm离心10min，将上清分别转移到一新50mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10min；4℃或室温，11000rpm离心10min，弃上清，倒置控干管内液体，倒置10～15min即可；此时管壁会出现白色沉淀物即质粒；

5）加入3mL ddH₂O或pH8.0的TE溶液溶解沉淀，并加入30μL 10mg/mL RNase A，37℃水浴1h除去RNA，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积的3M NaAc溶液，充分混匀，冰中或-20℃冰箱放置20min；4℃，11000rpm离心10min，将上清吸出，并将离心管倒置于滤纸上控干，加入100μL ddH₂O或pH8.0的TE溶液，充分洗脱质粒沉淀，利用分光光度计测量所得质粒的浓度并记录，分装封口后于-20℃保存备用；

C）DHFR-Ts* 抗性Marker的扩增：

1）利用引物DHFR-Fv：AAGCTTCGCCAGGCTGTAAA 和DHFR-Rv：GGAATTCATCCTG CAAGTGCATAG 扩增DHFR-Ts* 抗性基因，反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃复性30 sec；72℃延伸 3min30sec；30个循环；

2）使用OMEGA普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，利用分光光度计测量所得PCR产物的浓度并记录，分装封口后于-20℃保存备用；

D）弓形虫电击转染及获取阳性单克隆：

1）将I型虫株RH接种于75T HFF细胞中，当虫子裂解细胞75%时，用细胞刮子将虫体刮起，过22G的针头3-5次释放细胞内的虫子；

2）利用3.0μm的滤器过滤上述虫子去除细胞碎片，然后400g×10 min离心取沉淀，利用HBSS buffer重悬，再400g×10 min离心取沉淀；然后用Cytomix buffer重悬虫子使其浓度达到4×10⁷个/ml，Cytomix buffer配比为：120 mM KCl，0.15 mM CaCl₂ ，10 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄，25 mM HEPES，2 mM EDTA，5 mM MgCl₂，pH 7.6；

3）转染体系包括：RH 虫子Cytomix 混合液250μl，DHFR-Ts* 抗性基因片段1.5μg，pSAG1::Cas9-U6:: sgGRA17载体7.5μg，0.2 M、100×的ATP3μl，0.5 M、100×的谷胱甘肽3μl，Cytomix共300μl；将转染体系转移到4mm电击杯利用BTX ECM-830电转仪进行电转，电转程序为：电压1700 V, 电击时间176 μs ，电击两次，中间间隔100 ms，然后将电转的虫子转移到25T HFF细胞中；

4）在37℃，5% CO₂温箱培养48h后，加入3μM的乙胺嘧啶大约经过7-10天发现耐药性虫子；

5）利用有限稀释法进行耐药虫株的筛选，将耐药性的虫子按照5-10个每孔接种于96孔板，在37℃，5% CO₂温箱培养7-10天，在显微镜观察虫斑，选取每孔仅有1个虫斑的接种到24孔板中扩大培养；

6）重复步骤5）的有限稀释法，对虫株进行单克隆化，得到纯度为100%的遗传背景相同的虫株若干株；

7）将上述纯化的虫株接种到24孔板中扩大培养，培养的虫子吸取一部分到1.5ml的离心管中，提取该虫株的基因组；

8）PCR鉴定阳性虫株，将缺失株及野生虫株的基因组同时采用用下列引物： KO-GRA17-F: TCTACAAGCACGCAGAAAGGA 和R: CGAACCGGAAGTTACCACGAC进行扩增，反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃复性30 sec；72℃延伸 1min；30个循环，通过电泳检测扩增产物，检测野生株和突变株；

9）将对应的阳性克隆从24孔中接种到25T HFF 中扩大培养，并冻存到液氮中长期保存。