[发明专利]一株GRA17基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法在审

专利信息
申请号: 201611043674.5 申请日: 2016-11-24
公开(公告)号: CN106967608A 公开(公告)日: 2017-07-21
发明(设计)人: 王金磊;黄思扬;陈凯;侯俊玲;李法财;宋慧群;朱兴全 申请(专利权)人: 中国农业科学院兰州兽医研究所
主分类号: C12N1/11 分类号: C12N1/11;C12N15/79;C12N15/87
代理公司: 北京中恒高博知识产权代理有限公司11249 代理人: 姜司晨
地址: 730000 甘肃*** 国省代码: 甘肃;62
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摘要:
搜索关键词: gra17 基因 缺失 弓形虫 毒虫 突变 及其 制备 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及弓形虫弱毒虫株技术领域,具体涉及一株GRA17基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法。

背景技术

弓形虫病(Toxoplasmosis)是由弓形虫引起的一种人兽共患寄生虫病。全球约有三分之一的人口受其感染,弓形虫可以感染几乎所有的温血动物、传染性强、流行范围大、宿主谱广,目前尚无疫苗可用,因而防治该病的难度极大,对防治技术的要求很高。鉴于药物治疗弓形虫病能力有限且毒副作用大的特点,研制其疫苗已逐渐成为防控弓形虫病势在必行的重大任务。目前,抗弓形虫疫苗的类型主要包括全虫(灭)活疫苗、虫体特异组分疫苗、亚单位疫苗、病毒等活载体疫苗和蛋白及核酸疫苗等,然而大多数疫苗均不是很理想,为了增强免疫效果,提高免疫保护率,减毒活疫苗的疫苗研制将成为一个重要的研究课题。致密颗粒(Dense Granules, DG)是弓形虫的感染宿主的不可或缺的重要组成部分,致密颗粒所分泌的蛋白叫做致密颗粒蛋白(GRAs),致密颗粒蛋白以可溶的蛋白复合物的形式存在于致密颗粒内,有研究表示它是是构成弓形虫速殖子纳虫空泡膜和缓殖子囊壁的主要成分。在纳虫泡的形成过程中发挥重要的修饰调理作用,并与泡内的网络结构有关,是虫体能够在细胞内生存与复制的关键角色。免疫细胞化学研究揭示其在弓形虫速殖子、缓殖子包囊及肠内期虫体表膜上都有分布,后续多个研宄证实其在弓形虫急慢性感染中均具有较强的免疫原性,能够诱导机体产生明显、长效的体液和细胞免疫应答,抵抗弓形虫感染。随着不断发现的致密颗粒蛋白,对其的研究也不断深入。发现GRA蛋白家族中有些蛋白是很好的毒力因子,参与了弓形虫的入侵和复制,GRA17就是一个重要的毒力因子,因此构建GRA17家族基因缺失的弓形虫虫株将有望筛选到具有潜在应用价值的减毒活疫苗虫株。目前国际上仅有的能上市的弓形虫减毒活疫苗是S48,但是它仅限于对山羊和绵羊的应用。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷,提供了一株GRA17基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法。

为了实现上述目的,本发明提供的技术方案为:一株GRA17基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株,所述的GRA17基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株为LZ△GRA17(Toxoplasma gondil LZ△GRA17),保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2016年11月14日,保藏地址为:武汉武汉大学,邮编430072,保藏编号为CCTCC NO:V201656。

本发明的第二个目的是提供了上述一株GRA17基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株的制备方法,包括以下步骤:

A)pSAG1::Cas9-U6:: sg GRA17质粒构建:

1)利用网页软件设计GRA17的sgRNA为GACTGTCCCTGAGGACCCAT;

2)利用Q5定点突变试剂盒和扩增引物将GRA17的sgRNA替换pSAG1::Cas9-U6:: sgUPRT载体中的sgUPRT构建成pSAG1::Cas9-U6:: sg GRA17,扩增引物为gRNA-Fw: GACTGTCCCTGAGGACCCATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC和gRNA-Rv: AACTTGACATCCCCATTTAC;

3)PCR条件为:以pSAG1::Cas9-U6:: sgUPRT为模板,利用引物gRNA-Fw和gRNA-Rv进行pSAG1::Cas9-U6:: sgGRA17载体的PCR扩增,反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性 1min, 55℃复性1min;72℃延伸 5min;25个循环;

4)KLD反应:反应体系为PCR产物1μl,2X KLD Reaction Buffer 5μl,10X KLD Enzyme mix 1μl,ddH2O 3μl;在室温25度下反应5分钟;

5)转化:将上述KLD反应产物转化到大肠杆菌DH5α中,挑取若干单菌落,提取质粒,测序鉴定。测序正确的标记为pSAG1::Cas9-U6:: sgGRA17;

B)质粒大提:

1)挑取含pSAG1::Cas9-U6:: sgGRA17质粒的阳性菌液于含1000U/mL Amp+的LB固体选择培养基上划线,37℃培养过夜,挑取板上的一个单菌落置于4 mL LB液体选择培养基中,摇床37℃,180~220rpm培养12~16h,将上述培养菌液以1:100的比例接种到装有100mL LB培养基的500mL锥形瓶中,摇床37℃,180~220rpm培养过夜;

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