[发明专利]一种以恶臭假单胞菌为出发菌株构建三氯丙烷降解菌的方法

说明书

本发明公开了一种以恶臭假单胞菌为出发菌株建立三氯丙烷降解菌的方法。本发明属于环境技术修复领域，涉及一种在恶臭假单胞菌中稳定高效表达三氯丙烷降解途径中三个基因dhaA31，hheC和echA的方法及该工程菌的实际应用。优化外源基因的密码子，替换原始基因的启动子及核糖体结合位点，使用无痕的插入方法将优化后的表达框分别整合至恶臭假单胞菌的基因组中，得到稳定且高效表达三氯丙烷降解基因的工程菌。工程菌株接种至工业污水小试装置中，可以在两天内降解2mM/L的三氯丙烷。该发明的工程菌株在小试装置中的出色表现，使其在大规模处理工业污染废水中具有巨大的潜力。

技术领域

本发明属于环境技术修复领域，具体涉及一种以恶臭假单胞菌为出发菌株三氯丙烷降解菌株的构建方法.。

背景技术

人工合成物质1，2，3-三氯丙烷TCP在世界范围内的产量高达5000吨/年，被化学公司作为溶剂，上壤熏蒸剂的前体，及作为合成其他化合物的结构单元，例如二氯丙烯和聚砜类物质。TCP还是环氧氯丙烷合成过程中的副产品。在其大量的生产中，TCP经常在工业和有害废物的地点被发现。最近的一次加利福尼亚TCP污染引用水的事件表明亟需从环境中高效去除TCP这一有毒致癌物质的技术。目前还没有从环境中分离出有氧条件下利用TCP的菌株。

工程菌实际应用于有机物污染的修复必须具有遗传稳定、不含外源抗性等特点，将外源基因通过同源重组的方法整合到受体菌染色体上是一种理想的方法。另一方面，由于转基因微生物(基因工程菌)的复杂性和不确定性，其环境释放的安全性受到广泛关注，因此，工程菌在应用前必须进行环境释放安全性评价。人们所期望的结果是：投加的工程菌降解污中污染物以后，它们又会在污水中逐渐消亡，不会成为优势菌，也不会逃逸到释放区外，而且，工程菌的投加也不会对污水微生物数量和群落结构产生显著影响。

Pseudomonas putida是重要的环境微生物模式菌株，其基因组已在2002年被测序和解析。尽管Pseudomonas putida与致病的铜绿假单胞菌有极高程度的基因组保守性(分享85％的预测编码区域)，但是不存在关键的毒力因子包括外毒素A和III型分泌系统。Pseudomonas putida是第一个被美国卫生部重组DNA委员会认定为对环境安全的革兰氏阴性细菌，并允许该菌株作为基因工程的宿主菌。基因组序列分析表明，Pseudomonas putida在生物催化、生物降解和PHA合成等领域具有潜在应用价值。

由于Pseudomonas putida是一种理想的用于水环境修复的菌株，因此以Pseudomonas putida作为底盘细胞，导入不同功能的降解基因并实现它们在宿主菌中的异源表达，有望构建出生长速度快、降解能力强、降解谱广的新型工程菌。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种三氯丙烷降解菌的构建方法，是以Pseudomonasputida为出发菌株进行构建的，出发菌株分类名为恶臭假单胞菌。

本发明构建的三氯丙烷降解菌，是对从土壤环境分离得到的恶臭假单胞菌进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为插入与三氯丙烷降解途径中相关的多个基因；所述与三氯丙烷降解途径相关的多个基因为卤代烷脱卤酶(DhaA31)编码基因，卤代醇脱卤酶(HheC)编码基因和环氧化物水解酶(EchA)编码基因。

上述卤代烷脱卤酶(haloalkane dehalogenase)DhaA31的核苷酸序列为SEQ IDNO.1中的dhaA31序列；卤代醇脱卤酶(halohydrin dehalogenase)HheC的核苷酸序列表为SEQ ID NO.2中的hheC序列；环氧化物水解酶(expoxide hydrolase)EchA的核苷酸序列表为SEQ ID NO.3中的echA序列。

本发明的第二个目的是提供三氯丙烷于高浓度三氯丙烷环境下在提高三氯丙烷污染地下水中三氯丙烷降解率的应用，所述的高浓度三氯丙烷环境为含三氯丙烷摩尔浓度为0～2mM/L的水。

附图说明