[发明专利]提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及文库构建方法

说明书

本发明提供一种提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及文库构建方法。本发明的单细胞基因组扩增方法，采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行扩增，其包括：使一组引物、DNA聚合酶和单细胞基因组在溶液中接触；以及对所述溶液进行扩增，使得进行所述单细胞基因组的扩增反应；其中，所述扩增的时间为0.5小时以上且2小时以下。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种可提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及二代测序文库构建方法。

背景技术

单细胞测序技术(single-cell sequenceing)于2013年荣膺《Nature Mathods》年度技术，在癌症、辅助生殖和免疫学等领域具有广阔的应用前景。

单细胞基因组测序是在单细胞水平对全基因组进行扩增和测序的一项技术，其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后，进行高通量测序，用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。

单细胞的基因组是极其微量的，为满足文库质控，上机测序以及其他检测的需求，必须进行全基因组扩增以实现基因组线型或指数型增长。然而，单细胞基因组测序的主要流程包括：单细胞分离-单细胞全基因组扩增-测序文库制备-测序及数据分析。目前，就单细胞全基因组扩增而言，主要的扩增方法有三种：MDA(多重置换扩增)^[1]、DOP-PCR(简并寡核苷酸引物PCR扩增)^[2]以及MALBAC(多次退火成环循环扩增)^[3]。

MDA是一种等温的链置换扩增反应，其使用随机引物在多位点和模板链结合，接着利用phi29DNA聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增。

在扩增单细胞基因组后，进行测序文库的构建。目前，主流的基因组文库构建方法依照的是Illumina TruSeq DNA Sample Prep Workflow，其包括基因组DNA片段化、DNA片段末端修复、DNA片段3'端加“A”、DNA片段连接Y型接头、PCR富集等步骤。

从方法学角度来看，获得高覆盖率高保真性的单细胞全基因组扩增产物是准确全面的测序结果的保障。然而，就基因组覆盖度而言，上述三种单细胞全基因组扩增方法均不理想，最高也仅为60％左右，且呈现MDAMALBACDOP-PCR的趋势^[4]。

参考文献

1.Dean FB,Nelson JR,Giesler TL,Lasken RS.2001.Rapid amplification ofplasmid and phage DNA using phi29 DNA polymerase and multiply-primed rollingcircle amplification.Genome Res.11:1095–99。

2.Telenius H,Carter NP,Bebb CE,Nordenskjo M,Ponder BA,TunnacliffeA.1992.Degenerate oligonucleotide-primed PCR:general amplification of targetDNA by a single degenerate primer.Genomics 13:718–25。

3.Zong C,Lu S,Chapman AR,Xie XS.2012.Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.Science 338:1622–26。