[发明专利]高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化中的应用

权利要求书

1.一种高通量微阵列芯片的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)利用软蚀刻技术制备高通量凹陷小坑的SU-8模板，对模板进行低黏附修饰，确保SU-8与PDMS聚合物容易剥离；

(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS与引发剂按照体积比10～14：1混合，浇注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加热固化1～2h，常温剥离SU-8模板，得到高通量的固定间距的阵列微柱结构PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周边用PDMS模块围起形成局限的开放培养池，放于80℃烘箱内加热40～60分钟，得到微阵列芯片。

2.按照权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于：SU-8模板低黏附修饰具体为：采用硅烷化处理10-15分钟，80℃烘烤1～2小时，自然降温。

3.按照权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于：模板凹陷小坑的深度为500-1000微米，间距为30-100微米，微柱间距相同；其中微柱尺寸和微柱间距不限于该范围。

4.按照权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于：微柱尺寸为直径500-1000微米，高度为500-1000微米，间距为30-100微米，微柱间距相同。

5.按照权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于芯片形状为圆形或者方形。

6.一种高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化中的应用，其特征在于：利用上述芯片高通量形成拟胚体并进行原位干细胞来源的类心肌组织诱导分化，具体步骤为：

(1)芯片无菌化：将上述微阵列芯片用氧等离子处理1～3分钟，加入去离子水；120～125℃高压灭菌20～30分钟；将芯片置于无菌的培养皿中4℃保存或降至室温后使用。

(2)芯片低粘附处理：利用低粘附试剂处理4～24小时，去除试剂用PBS清洗5～10次；

(3)拟胚体形成：取出芯片，加入mTeSR1培养基，不断用移液器吹打，去除小柱间的气泡，使微柱间隙充满培养基；将人诱导性多潜能干细胞(hiPSCs)用分散酶消化成单细胞，将密度在5×10⁶-10×10⁶个hiPSCs/cm²细胞接种到(2)所述的芯片中，加入1.5～2ml的mTeSR1培养基，并加入10～20μM的Y27632。静止培养24～48小时；根据细胞接种数量实现拟胚体大小的控制，(5-10)x10⁶/cm²范围的细胞密度可以实现150-300微米直径的细胞球；

(3)类心肌组织诱导分化：拟胚体形成后，加入2ml诱导分化培养基1640/B27-insulin，添加终浓度在6～12μM的CHIR99021作用24～30小时；以加入CHIR99021作为诱导分化第1天，第2、3天分加入2ml诱导培养基1640/B27-insuline，第4、5天分别加入2ml诱导分化培养基1640/B27-insulin，添加终浓度6～12μM的IWP2；第7天以后加入2ml心肌细胞培养基1640/B27，每隔1天更换新鲜心肌细胞培养基；

(4)不同形状类心肌微组织形成：通过增加细胞密度，形成不同形状、尺寸的三维类心肌微组织，原位观察微组织的生长、发育；

(5)所形成的类心肌微组织可以用于切片，组织染色。

7.按照权利要求6所述一种高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化的应用，其特征在于：所述诱导分化培养基1640/B27-insulin基础成分为RPMI1640，另外添加占总体积2％的B27-insulin,占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，终浓度10ug/ml抗支原体药物，终浓度10ug/ml Gentamicin,终浓度0.25ug/ml Amphotericin B。