[发明专利]高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化中的应用

说明书

本发明提供一种高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化中的应用，该应用为在阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片上形成高通量的人诱导性多潜能干细胞的3D拟胚体结构并原位进行类心肌组织的诱导分化。该方法可以高通量形成大小均一的类心脏微组织，并可以原位动态观察类心脏微组织的生长、发育的全过程。该方法克服了传统拟胚体形成和3D心肌诱导分化分步实现的缺点，具有简化实验操作步骤，高通量、原位动态观察心肌发育的优势，无需特殊的仪器和试剂，可与其他技术集成化。主要用于人心脏发育学、疾病模型构建、心脏药物及毒物评估等领域。

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化中的应用。

背景技术

心脏是人体重要的脏器之一，先天性心脏病以及成人心脏病严重威胁人类健康和生命。利用人源性的心肌细胞和类心肌组织来研究心脏发育学、疾病机制、药物评价及毒性实验具有重要的科学意义。人诱导性多潜能干细胞和胚胎干细胞具有自我更新和多向分化的能力，利用3维拟胚体结构进行心肌组织的发育学研究及疾病模型构建具有重要的应用价值。传统方法是利用悬滴法、商品化的小坑结构先形成拟胚体，再将拟胚体转移到低粘附的培养皿中，进一步进行心肌细胞诱导分化。在转移过程中，拟胚体容易收到较大流体的剪切力刺激，干扰细胞的活性和分化的效果。传统的培养皿需要大量的培养基，费用较为昂贵，在换液过程中也会丢失部分拟胚体造成细胞浪费。此外由于心肌细胞的跳动特性，无法定位观察心肌组织的发育和药物反应。

制备高通量阵列微柱结构的芯片的材料为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，PDMS是目前微加工和微流控领域用的最多的材料，具有透明、透气、惰性好、疏水性、易成型、细胞相容性佳等优势。目前文献报道的利用芯片进行心肌诱导分化的方法都是基于聚合物凝胶材料的小坑法形成拟胚体，再将拟胚体转移到新的低黏附培养系统，步骤繁琐；转移过程中对干细胞会造成一定程度的损伤，细胞碎屑不容易清除等缺点。低粘附悬浮培养心肌微组织，不能实时定位观察同一个拟胚体来源的类心肌微组织的发育分化过程。

目前利用微流控芯片制备的微柱结构中，主要以微小尺度为主，用于研究表面拓扑结构对单细胞行为学的影响，尚无利用较大微柱形成微培养空间进行拟胚体形成和原位发育研究的应用。

因此，本发明主要针对上述人干细胞源3维类心肌组织分化的局限性，制备一种高通量微阵列芯片用于人诱导性多潜能干细胞的类心肌微组织分化，用于干细胞领域的应用研究。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是制备一种高通量微阵列芯片用于干细胞类心肌组织诱导分化。

一种高通量微阵列芯片的制备方法，具体步骤如下：

(1)利用软蚀刻技术制备高通量凹陷小坑的SU-8模板，对模板进行低黏附修饰，确保SU-8与PDMS聚合物容易剥离；

(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS与引发剂按照体积比10～14：1混合，浇注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加热固化1～2h，常温剥离SU-8模板，得到高通量的固定间距的阵列微柱结构PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周边用PDMS模块围起形成局限的开放培养池，放于80℃烘箱内加热40～60分钟，得到微阵列芯片。

SU-8模板低黏附修饰具体为：采用低粘附试剂硅烷化处理10-15分钟，80℃烘烤1～2小时，自然降温。

模板凹陷小坑的深度为500-1000微米，间距为30-100微米，微柱间距相同；其中微柱尺寸和微柱间距不限于该范围。

微柱尺寸为直径500-1000微米，高度为500～1000微米，间距为30-100微米，微柱间距相同。

所述模板低粘附处理试剂为三甲基氯硅烷或者氟硅烷等；