[发明专利]基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒

权利要求书

1. 基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括α和β地中海贫血累及的HBA1和HBA2以及HBB三个基因的外显子、调控、转录区间的PCR扩增引物序列和两端PCR标记引物序列，其中PCR扩增引物序列为SEQ ID NO：1-17，两端PCR标记引物序列分别为5’端PCR标记引物序列SEQ ID NO：18-115及3’端PCR标记引物序列SEQ ID NO：116-213；

所述的试剂盒还包括第二代测序仪，所述测序仪为solexa测序仪；

所述试剂盒的使用方法具体步骤如下：

（1）、构建第二代测序文库；

（2）、第二代测序文库纯化：向50μL PCR产物中，加入35μL贝克曼磁珠，移入1.5mL PE管，漩涡振荡混匀，室温静止5min后，移入磁力架，待液体澄清后，除去上清，加入70%酒精500μL，静置1min后移除上清，再加入500μL 70%的酒精，1min后移除；室温干燥5min，待酒精挥发后，将标本移下磁力架后，加入27μL TB溶液，充分混匀后，静置3min；再次振荡混匀，再静置3min后，将标本上磁力架，待澄清后，取25μL上清保存；

（3）、第二代测序仪测序：利用illumina MiSeq Reagent Kit 300cycles PE试剂盒测序，将200个标本等量混合后，文库混合液稀释到12pmol/μL，并使其变性，制备所需的预填充试剂盒，将文库混合液装到指定槽的试剂盒中，设置实验步骤并检查各运行参数，选择Sequence开始运行，实验结束后查看测序结果；

（4）、生物信息学分析，获得结果；首先对新一代测序数据进行预处理，包括剪除3 '端质量值低于20的序列、去除平均质量值低于20的序列；然后使用bwa将质控后的序列比对到版本号hg19的参考基因组序列上，利用GATK工具判读SNP和Indel位点；利用SNPnexus工具注释SNP，找到可能性的功能性位点，最后利用dbSNP、千人基因组数据库、HGMD数据库、clinvar数据库进行注释和比较，从而检测α和β地中海贫血点突变；

所述的步骤（1）构建第二代测序文库，包括以下几个步骤：

1）、准备样品DNA，用常规方法提取全基因组DNA；

2）、准备引物：将合成的引物加TE溶液稀释到10μM；将PCR扩增引物按以下体系混合成MIX：SEQ ID NO：1-17所示PCR扩增引物的浓度均为10mM；体积分别为0.4、0.4、0.6、0.6、0.6、0.6、0.4、0.4、2.5、2.5、3.5、3、6.5、1、1、0.6、0.6μL；

3）、多重PCR构建测序文库：在PCR体系中，加入2μL DNA、25μL 2×Multiplex PCRBuffer和0.25μL Multiplex PCR Enzyme Mix，以及2μL PCR扩增引物MIX和5’端和3’端特异标记引物各1μL，最后加去离子水至50μL进行PCR反应；PCR检测的反应程序为：预变性5min；然后95℃变性45s，60℃退火1.5min，72℃延伸1min扩增20循环。