[发明专利]基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒

说明书

本发明涉及一种基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的方法及试剂盒，检测方法包括α和β地中海贫血累及的HBA1和HBA2以及HBB三个基因的外显子、调控、转录区间的PCR扩增引物序列SEQ ID NO1‑17和5’端PCR标记引物序列SEQ ID NO18‑115以及3’端PCR标记引物序列SEQ ID NO116‑213；检测步骤为：（1）、构建第二代测序文库；（2）、第二代测序文库纯化；（3）、第二代测序仪测序；（4）、生物信息学分析，获得结果；检测用的试剂盒包括前述所述的引物序列及第二代测序仪solexa。本发明的检测方法具有操作步骤简单，检测特导性高，检测范围广、成本低等特点。

技术领域

本发明涉及一种基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的方法及试剂盒，属于分子生物学领域。

背景技术

地中海贫血( thalassemia)，即珠蛋白生成障碍性贫血，是一组由珠蛋白基因缺失或点突变致使珠蛋白肽链合成部分或完全抑制的遗传性溶血性贫血疾病。临床表现根据病情严重程度不同而有所差异，患者主要以贫血、黄疸、肝脾肿大为突出表现。珠蛋白肽链分为α、β、γ、δ种，而地中海贫血主要有α、β、δβ、δ四种类型，以前两种(α、β地中海贫血) 最常见。在我国广西地区人群中总的携带率高达24.5%。此病目前缺乏有效治疗手段，应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。

在我国南方地区主要以α缺失型突变为主，但是点突变也占有很大比率，在广西人群携带率高达9.64%，且不同的点突变对应的表型存在明显的差异。然而目前世界上已经报道的α基因非缺失突变超过200种，β基因超过500种类型。但是目前针对非缺失型地中海贫血的分子诊断的PCR-反向斑点杂交法，其检测范围十分有限，包括我国常见的17种β点突变以及3种α点突突（α^WS、α^QS、α^CS），极有可能造成漏诊，导致重症患儿出生。因此，现在迫切的需要一种方法对多种点突变进行快速检测。

检索到以下关于地中海贫血基因点突变的检测方法的专利：

1、中国专利，申请号：201310528510.1；申请人：苏州发士达生物科技有限公司；发明名称：一种用于β- 地中海贫血β17(A→T) 点突变的检测试剂盒及 ARMS-QPCR 检测方法；摘要：本发明公开了一种用于β-地中海贫血β17(A→T) 点突变的检测试剂盒及 ARMS-QPCR检测方法，其特征在于：检测试剂盒包括 PCR 反应液Ⅰ、PCR 反应液Ⅱ、混合酶液、DNA提取液、阴性对照液和阳性对照品；ARMS-QPCR 检测方法包括样品采集、ARMS 引物设计、样品处理等步骤。本发明提供的一种用于β- 地中海贫血β17(A→T)点突变的检测试剂盒检测待检β- 地中海贫血β17(A→T) 点突变的 DNA 样品时，只需3小时即可完成检测，同时采用实时荧光定量PCR法检测β- 地中海贫血β17(A→T) 点突变基因特异性较强，检测灵敏度高，方法简单，误差小，准确度高。

2、中国专利，申请号：201410510185.0；申请人：广东省妇幼保健院；发明名称：一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法；摘要：本发明公开一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法。本发明利用锁核酸能灵活修饰探针的特点，设计出用于检测地中海贫血基因点突变的探针，这些探针分别与不同编码的微珠进行耦联；然后设计本发明的特异性引物对突变位点进行扩增得到 PCR 产物，将其与耦联有探针的微珠进行杂交，再用荧光标记试剂进行荧光标记，最后通过液相芯片检测仪进行突变位点的检测。本发明基于LNA 增敏的探针较常规的探针长度缩短，但仍能保持较高的Tm值，使得完全匹配的探针和错配的探针杂交信号比值从原来的不到 2 倍提高到超过 4 倍以上的差异，因而容易区分。