[发明专利]一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立及其应用

权利要求书

1.一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：将滤纸置于细胞培养24孔板中，在其上包被一层细胞外基质，然后在其上面先后种上一种内皮细胞和肝细胞，两种细胞共培养一定时间后，得到具有肝特异性功能的三维肝组织，并能进行体外长期培养。

2.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述的肝细胞包括人原代肝细胞、肝细胞系或肝癌细胞系所有具有肝细胞结构和特异性功能的肝细胞。

3.按照权利要求2所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述肝细胞为一种由成纤维细胞直接诱导转分化而来的肝细胞hiHep，此细胞系含有稳定转染的大T抗原的EGFP基因，可自发绿色荧光。

4.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述内皮细胞包括肝窦内皮细胞、脐静脉内皮细胞、微血管内皮细胞所有具有血管内皮特征和功能的细胞。

5.按照权利要求4所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述内皮细胞为脐静脉内皮细胞HUVEC。

6.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述的细胞外基质包括胶原、基质胶在内的所有天然类及合成类的细胞外基质。

7.按照权利要求6所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述细胞外基质为I型鼠尾胶原。

8.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述的内皮细胞HUVEC和肝细胞hiHep共培养时的接种比例为1:1～2。

9.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述共培养中所用的培养基为hiHep细胞用培养基，基础成分为DMEM/F12(1:1)，再加入占总体积1％的ITS(100X)，终浓度为40ng/ml的TGFa，终浓度为40ng/ml的EGF，终浓度为10mM的地塞米松，终浓度为2g/L的BSA，终浓度为2g/L的半乳糖，终浓度为0.1g/L的鸟氨酸，终浓度为0.3g/L的脯氨酸，终浓度为0.61g/L的烟酰胺、终浓度0.544mg/L氯化锌，终浓度0.75mg/L硫酸锌，终浓度0.2mg/L硫酸铜，终浓度0.025mg/L硫酸锰、以及占总体积1％的penicillin‐streptomycin(100×)。

10.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的应用，其特征在于该模型用于研究肝细胞特异性功能；其操作步骤如下：

(1)以单层培养hiHep肝细胞为对照组，检测三维共培养肝模型的脂质和糖原合成情况；

(2)以单层培养hiHep肝细胞以及纸上三维培养肝细胞为对照组，用免疫荧光方法检测三维共培养肝模型的白蛋白表达水平。

11.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的应用，其特征在于所述三维肝模型用于研究其在体外长期培养过程中的细胞表型和肝特异性功能，其操作步骤如下：

(1)按照前述方法建立三维共培养肝模型，分别在第7天、第31天、第60天、第103天进行三维肝模型的形态学表征；

(2)按照前述方法建立三维共培养肝模型，定期收集细胞培养上清液，共收集培养到第75天的样品，并收集二维单层肝细胞培养前三天的上清液样品作为对照组，用于定量检测整个培养过程中肝细胞的白蛋白分泌和尿素合成水平。

12.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的应用，其特征在于所述三维肝模型可用于研究用于人体的临床口服药物的肝毒性评价及新药开发。