[发明专利]一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立及其应用

说明书

本发明提供了一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立及其应用，该模型主要基于肝脏正常的生理结构特点，利用成纤维细胞直接诱导转分化而来的肝细胞hiHep，对传统的原代肝细胞或肝细胞系单层培养模型进行改进，将定性滤纸作为细胞培养的支架材料，将滤纸放置24孔板中使滤纸悬浮在培养液中，可进行充分的物质传输和营养成分的交换，从而使细胞在滤纸上进行三维生长。所述基于滤纸的肝模型即在定性滤纸上进行hiHep细胞与脐静脉内皮细胞HUVEC共培养，实现了一种可体外长期培养并维持肝特异性功能的三维肝组织，利用它可以在体外进行一系列的肝毒性药物的测试及评估，其主要作用是在体外研究药物分子对肝脏组织的长期毒性及肝功能损伤的过程。

技术领域

本发明属组织工程及药物研究领域，具体涉及一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立及其应用。

背景技术

人体众多器官中，肝脏是人体内最大的腺体，有非常复杂的微结构，并拥有物质代谢、血液解毒和血浆蛋白分泌等多种功能，尤其是药物和毒素代谢功能，对维持机体的稳定和代谢起到重要的作用。然而目前各种肝脏疾病严重威胁着人类健康，肝脏疾病的研究以及药物筛选、毒性检测方面大都还是依赖于动物实验和临床研究。由于物种之间的差异性，动物实验的结果难以完全转化到临床中，药物开发受到严重制约。而且在肝组织工程中，治疗肝衰竭的传统的肝脏移植方法一直面临着器官供应短缺、免疫排斥以及伦理争议等诸多问题。因此体外构建有功能性的肝组织或肝模型在研究药物代谢、疾病模型构建、生物人工肝反应器、细胞移植治疗等方面有着非常重要的研究和临床应用价值。

肝细胞在体内有很强的再生功能，然而一旦剥离出肝脏或以传统二维培养模式进行体外培养，就会很快失去增殖能力，丧失表型和正常的肝功能。因此在体外构建功能性的肝组织过程中，对体内肝细胞复杂微环境的模拟，实现体外肝细胞的三维培养，进而有效维持肝细胞的分化表型和改善肝细胞功能，就尤为重要。目前，体外维持肝细胞功能的方法有多种，包括利用非粘附性表面或带有凹形微孔结构的芯片形成肝细胞球，中空纤维以及液滴包埋技术形成肝组织，或者用图案化的细胞外基质和水凝胶支架材料构建肝组织。然而传统的肝模型或肝反应器拥有许多的局限性，如肝细胞种类和来源有限，生物材料的性能及安全性差，体外细胞生长微环境难以长期维持，培养体系复杂难以扩大等。滤纸作为一种商业化、低成本、用途广泛的材料，它的生物兼容性、稳定性较好，并且由束状纤维素微纤维形成多孔的三维结构，因此滤纸非常适合作为细胞三维培养的支架材料。目前尚未有报道利用滤纸材料进行肝细胞的培养，并构建可进行体外长期培养的三维肝组织模型。

发明内容

基于上述原因，本发明利用一种新型肝细胞hiHep作为肝细胞来源，在滤纸上与脐静脉内皮细胞HUVEC共培养构建三维肝组织模型。该培养体系能够近似模拟体内肝组织微环境，使肝细胞形态和功能较长时间地维持，可以作为动物实验的替代方法，在体外实现药物长期作用于肝组织的毒性检测或药物筛选的能力。

本发明的目的是提供一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立及应用，该模型可在体外长期维持肝细胞结构和功能，可用于药物筛选和毒性检测以及药物开发等应用。

本发明提供了一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立，具体步骤为：

将滤纸置于细胞培养24孔板中，在其上包被一层细胞外基质，然后在其上面先后种上一种内皮细胞和肝细胞，两种细胞共培养一定时间后，得到具有肝特异性功能的三维肝组织，并能进行体外长期培养。

本发明提供的一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立，所述肝细胞包括人原代肝细胞、肝细胞系、肝癌细胞系所有具有肝细胞结构和特异性功能的肝细胞。优选为一种由成纤维细胞直接诱导转分化而来的肝细胞hiHep，此细胞系含有稳定转染的大T抗原的EGFP基因，可自发绿色荧光。

本发明提供的一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立，所述内皮细胞包括肝窦内皮细胞、脐静脉内皮细胞、微血管内皮细胞所有具有血管内皮特征和功能的细胞，优选为脐静脉内皮细胞HUVEC。