[发明专利]一种双齿围沙蚕抗凝血肽的制备方法

权利要求书

1.一种双齿围沙蚕抗凝血肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)样品预处理：新鲜双齿围沙蚕经预处理后得组织匀浆；

(2)酶解：按照每克组织匀浆加3mL纯净水的配比，将组织匀浆与纯净水混匀，调节pH＝10，加入碱性蛋白酶酶解后得酶解液；

(3)超滤：酶解液灭活，离心，取上清液，经超滤获得分子量小于3kd的活性组分；

(4)阴离子交换层析：分子量小于3kd的活性组分经DEAE-Sepharose FastFlow阴离子交换层析，梯度洗脱，于280nm波长下检测，收集所得洗脱峰，冷冻干燥，筛选抗凝血活性最高的洗脱峰作为阴离子交换层析产物用于下一步分离纯化；

(5)葡聚糖凝胶G25层析：将抗凝血活性最高的阴离子交换层析产物采用葡聚糖凝胶G25层析继续分离纯化，蒸馏水洗脱，于280nm波长下检测，收集所得洗脱峰，冷冻干燥后作为葡聚糖凝胶G25层析产物；

(6)反相高效液相色谱分离纯化：对葡聚糖凝胶G25层析产物采用反相高效液相色谱法分离纯化，最终获得双齿围沙蚕抗凝血肽；所述双齿围沙蚕抗凝血肽的氨基酸序列为Pro-Val-Glu-Arg-Lys。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)样品预处理具体为：将新鲜双齿围沙蚕用清水清洗干净，沥干后称重，组织捣碎机匀浆，加匀浆3倍体积的预冷的磷酸盐缓冲液，4℃静置2h以上，离心，收集上清，上清液用医用脱脂棉过滤。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH＝7.0。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)按照每克组织匀浆加1500U的加酶量加入碱性蛋白酶，45℃酶解5小时得酶解液。

5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)洗脱的流速为1.5mL/min，预先用pH7.4，0.02mol/L Tris-HCl平衡缓冲液充分平衡DEAE柱3-5个柱体积，然后上样。

6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)的蒸馏水的洗脱速度为1.1mL/min。