[发明专利]一种双齿围沙蚕抗凝血肽的制备方法

说明书

本发明公开了一种双齿围沙蚕抗凝血肽的制备方法，步骤包括：(1)样品预处理；(2)酶解；(3)超滤；(4)阴离子交换层析；(5)葡聚糖凝胶G25层析；(6)反相高效液相色谱分离纯化；最终获得双齿围沙蚕抗凝血肽。本发明安全性好，反应条件温和，过程控制容易，所得双齿围沙蚕抗凝血肽纯度高，抗凝血活性好，具有抗血栓作用，具有较好的医学应用价值。

技术领域

本发明涉及一种活性肽的制备方法，特别涉及一种双齿围沙蚕抗凝血肽的制备方法。

背景技术

血栓形成是缺血性心脏病、缺血性中风及静脉栓塞常见的病理学基础，严重危害人类健康且近年来还有渐增之势。抑制血小板的聚集与释放、抑制凝血酶系统、激活抗凝血酶及纤溶酶系统均可抑制血栓的形成。血栓的形成是缺血性心脑血管疾病及血栓栓塞性疾病的主要病理过程，与疾病的发生、发展密切相关。因此，抑制血小板聚集、抑制血栓的形成对心脑血管系统疾病及其他血栓栓塞性疾病的防治均有重要意义。

双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)隶属于动物界，环节动物门，多毛纲，游行多毛目，沙蚕科，俗称海蜈蚣，与陆地生物蚯蚓具有很近的亲缘关系。从蚯蚓体内获得的蚯激酶已被证明能够有效溶解血栓，改善微循环，加强心、脑血管侧支循环，蚯激酶的成功开发使科研工作者将目光转向沙蚕。通过酶解的方法从沙蚕体内提取抗凝血成分以抑制体内血栓，未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双齿围沙蚕抗凝血肽的制备方法，安全性好，反应条件温和，过程控制容易，所得双齿围沙蚕抗凝血肽纯度高，抗凝血活性好，具有抗血栓作用，具有较好的医学应用价值。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种双齿围沙蚕抗凝血肽的制备方法，步骤如下：

(1)样品预处理：新鲜双齿围沙蚕经预处理后得组织匀浆；

(2)酶解：按照每克组织匀浆加3mL纯净水的配比，将组织匀浆与纯净水混匀，调节pH＝10，加入碱性蛋白酶酶解后得酶解液；

(3)超滤：酶解液灭活，离心，取上清液，经超滤获得分子量小于3kd的活性组分；

(4)阴离子交换层析：分子量小于3kd的活性组分经DEAE-Sepharose FastFlow阴离子交换层析，梯度洗脱，于280nm波长下检测，收集所得洗脱峰，冷冻干燥，筛选抗凝血活性最高的洗脱峰作为阴离子交换层析产物用于下一步分离纯化；

(5)葡聚糖凝胶G25层析：将抗凝血活性最高的阴离子交换层析产物采用葡聚糖凝胶G25层析继续分离纯化，蒸馏水洗脱，于280nm波长下检测，收集所得洗脱峰，冷冻干燥后作为葡聚糖凝胶G25层析产物；

(6)反相高效液相色谱分离纯化：对葡聚糖凝胶G25层析产物采用反相高效液相色谱法分离纯化，最终获得双齿围沙蚕抗凝血肽。

本发明首次通过酶解的方法从沙蚕体内提取抗凝血成分，获得具有抗凝血活性的沙蚕寡肽，具有抗血栓作用，具有较好的医学应用价值。

作为优选，步骤(1)样品预处理具体为：将新鲜双齿围沙蚕用清水清洗干净，沥干后称重，组织捣碎机匀浆，加匀浆3倍体积的预冷的磷酸盐缓冲液，4℃静置2h以上，离心，收集上清，上清液用医用脱脂棉过滤。

作为优选，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH 7.0。

作为优选，步骤(2)按照每克组织匀浆加1500U的加酶量加入碱性蛋白酶，45℃酶解5小时得酶解液。

作为优选，步骤(4)洗脱的流速为1.5mL/min，预先用pH7.4，0.02mol/LTris-HCl平衡缓冲液充分平衡DEAE柱3-5个柱体积，然后上样。

作为优选，步骤(5)的蒸馏水的洗脱速度为1.1mL/min。