[发明专利]高产白藜芦醇突变体筛选方法的建立

说明书

本发明涉及白藜芦醇的生产领域。具体地，涉及用于白藜芦醇生产的4CL1酶突变体。具体地，例如，该突变体相对于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第169位氨基酸由Glu突变为Asp，第536位氨基酸由Phe突变为Tyr。

技术领域

本发明涉及白藜芦醇的生产。具体地，涉及用于白藜芦醇生产的4CL1酶突变体，以及筛选该突变体的调控蛋白TtgR的突变体。

背景技术

白藜芦醇最初是发现于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物。具有抗菌消炎、抗氧化、抗癌、预防心血管疾病等多种药用价值。目前市场上的白藜芦醇多通过从虎杖中通过化学提取得到。虽然目前已经实现在大肠杆菌及酵母中利用来源于植物的基因合成白藜芦醇。但现有的白藜芦醇检测手段仅限于高效液相色谱，缺乏可视化、高通量的检测筛选方法。无法方便、快捷地将白藜芦醇的产量在微生物细胞的合成中进行产量最大化的优化。

发明内容

本发明通过改造调控蛋白TtgR，使其能够响应白藜芦醇的浓度，从而通过调节lacZ基因的表达，利用蓝白斑的原理，快速高效地筛选出产生白藜芦醇菌株。该方法节省时间，简化了筛选步骤。

一方面，本发明涉及调控蛋白基因ttgR的突变体，其特征在于编码序列如SEQ IDNO：9所示，其编码的氨基酸序列相对于野生型调控蛋白TtgR而言，第38位氨基酸由丙氨酸突变为了苏氨酸，其中所述野生型调控蛋白TtgR由SEQ ID NO：5编码。

在另一方面，本发明涉及4CL1酶的突变体，其特征在于选自由以下各项组成的组：

(1)相对于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第169位氨基酸由Glu突变为Asp，第536位氨基酸由Phe突变为Tyr；

(2)相对于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第48位氨基酸由Ile突变为Ser或Thr，第112位氨基酸由Phe突变为Leu或Ile，Val，Ala，Gly或Trp；

(3)相对于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第250位氨基酸由Ile突变为Leu，Val，Ala或Gly，第404位氨基酸由Asn突变为切s，Arg，Tyr或Phe，第461位氨基酸由Ile突变为Val，Leu，Ala或Gly；

(4)相对于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第31位氨基酸由Asp突变为Thr或Ser，第510位氨基酸由Ser突变为Gln或Asn；

(5)相对于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第221位氨基酸由Met突变为Phe或Tyr；

(6)相对于氮基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第48位氨基酸由Ile突变为Ser或Thr，第112位氨基酸由Phe突变为Leu，Val，Ala或Gly，第169氨基酸由Glu突变为Asp或Glu；第536位氨基酸由Phe突变为Tyr。

在另一个方面，本发明还涉及质粒，其图谱如图1a或图1b所示。

在另一个方面，本发明还涉及上述的调控蛋白基因ttgR的突变体，其在筛选用于提高白藜芦醇产量的4CL1酶突变体或筛选产生白藜芦醇菌株中的应用。

在另一个方面，本发明还涉及一种生产白藜芦醇的方法，其特征在于上

述获得的所述4CL1酶突变体。