[发明专利]一种环己酮单加氧酶及其应用

说明书

本发明公开了一种环己酮单加氧酶及其应用，特别是公开了一种通过定点突变获得的环己酮单加氧酶及其应用，与SEQ ID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第386位丝氨酸Ser突变成天冬酰胺Asn，第435位丝氨酸Ser突变成苏氨酸Thr。实验表明，本发明的环己酮单加氧酶能够将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑。

技术领域

本发明属酶工程技术领域，涉及一种通过基因定点突变获得的环己酮单加氧酶及其应用，特别涉及所述环己酮单加氧酶在将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑中的应用。

背景技术

埃索美拉唑和奥美拉唑都是用于治疗胃溃疡的质子泵抑制剂(Proton pumpinhibitors，PPIs)，其中埃索美拉唑是S构型的奥美拉唑，其化学名称为5-甲氧基-2-((S)-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，CAS登录号为119141-88-7，化学结构如下式I所示。奥美拉唑的化学名称为5-甲氧基-2-(((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，CAS登录号为73590-58-6，其化学结构如下式II所示。

与奥美拉唑相比，埃索美拉唑具有肝脏首过效应低、血药浓度高、血浆半衰期长、生物利用度高、药物间相互作用小、药效强而持久等优势，尤其适合用于特殊人群，如老年人、肾功能不全和轻中度肝功能不全患者。此外，埃索美拉唑还适用于已经治愈的食管炎患者防止复发的长期维持治疗，与适当的抗菌疗法联合用药可根除幽门螺杆菌，并且能愈合与幽门螺杆菌感染相关的十二指肠溃疡，防止与幽门螺杆菌相关的消化性溃疡复发。埃索美拉唑以其卓著的品质名列2004年全球畅销药物第5位，销售额高达43亿美元。

目前，已报道的埃索美拉唑的化学合成方法主要有拆分法和氧化法。专利CN103288801A公开了一种高纯度埃索美拉唑钠的制备方法，其通过向奥美拉唑钠溶液中加入三乙胺和L-(+)-扁桃的酸溶液实现拆分目的，然而该方法收率比较低，生产成本比较大，不适合工业化生产。专利CN 102807560B公开了一种不对称氧化合成埃索美拉唑的方法，以手性配体(S,S)-6,6’-二羟基-2,2’-联苯二甲酸二乙酯与四异丙氧基钼形成的络合物为催化剂，以异丙基过氧化氢为氧化剂，对奥美拉唑硫醚物进行不对称催化氧化得到埃索美拉唑。但是由于该方法采用的催化剂比较复杂，市场很难获得，氧化剂异丙基过氧化氢比较昂贵，因此不适合规模化生产应用。

埃索美拉唑的生物酶合成法具有反应收率高，产物手性选择性好，且无需重金属手性配体的优势。US 5840552A通过筛选获得一系列可用于生物氧化反应的菌株，制备埃索美拉唑，其催化手性选择性较好，产物ee值大于99％，但是缺点是产物浓度较低，为ppm级别。CN 102884178A公开了一种非天然存在的单加氧酶，用于催化合成拉唑类化合物，然而其一批反应可催化的底物浓度比较低(33g/L)，不利于工业化大规模应用。

发明内容

为了克服现有的生物酶合成法中反应底物奥美拉唑硫醚浓度过低的缺陷，本发明利用酶基因工程技术来对现有技术的环己酮单加氧酶进行改造和筛选，构建高酶活性的环己酮单加氧酶，从而可将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑。

因此，本发明的第一个目的是提供一种可将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑的环己酮单加氧酶。与SEQ ID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第386位丝氨酸(Ser，S)突变成天冬酰胺(Asn，N)，第435位丝氨酸(Ser，S)突变成苏氨酸(Thr，T)。其中SEQ ID NO:1是现有的NCBI登录号为578026767的环己酮单加氧酶的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第111位苏氨酸(T)突变成丝氨酸(S)，第386位丝氨酸(S)突变成天冬酰胺(N)。