[发明专利]一种癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫传感器领域，具体涉及一种癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法和检测方法。

背景技术

癌胚抗原(CEA)是一种分子量极大的糖蛋白，常用于肿瘤标记。CEA浓度的检测不仅可以用于胃肠道和呼吸道的肿瘤诊断，还可以通过检测人体内癌胚抗原的含量及量的变化，表明肿瘤的性质，从而对肿瘤的诊断、病程分析及指导临床治疗起辅助作用。因此CEA浓度的测定对临床肿瘤诊断具有重大的意义。癌胚抗原的定量检测方法最常见的分析方法包括荧光免疫法，酶联免疫吸附测定法，电化学免疫传感器测定法，放射免疫测定法，电化学发光免疫测定法和质谱免疫测定法。其中电化学免疫传感器测定法具有分析速度快、仪器装置简便、灵敏度高等优点。

电化学免疫传感器可分为阻抗型免疫传感器、电容型免疫传感器、电位型传感器和电流型传感器。电流型免疫传感器是在电位一定的情况下测定由于抗原抗体特异性结合成复合物后电流的改变，它又分为酶标记型和非酶标记型。目前，常用的非酶标记型电化学免疫传感器如化学(物理)吸附、共价键结合、交联法、嵌入法等，都暴露出检测时间长、费用高、生物分子稳定性低、生物分子失活性高、步骤复杂的缺点。而酶标记型电化学免疫传感器有很多酶可以用于酶标记型免疫传感器，如辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶和脲酶。酶生物传感器是通过检测酶促反应产生的H₂O₂，但这类酶生物传感器会受到溶解氧的严重影响而导致电化学响应不稳定。常用的生物电化学传感器都需要比较复杂的检测步骤，并且需要彻底清洗才能使用，非常容易使检测结果出现错误。

发明内容

本发明的目的在于提供一种癌胚抗原电化学免疫传感器，其具有灵敏度高、结果准确可靠、成本低、快速、使用方便且制备过程极其简单的特点。

为达到上述目的，本发明的技术方案为，其制备方法具体步骤如下：

步骤1：取聚邻苯二胺纳米微球0.013g，利用超声震荡分散在1mL的水中，并在室温下保存备用；

步骤2：将玻碳电极:用清洗剂超声清洗5～10min后，在沉积电位为1.75V下，0.1M pH＝5.0的PBS中，用线性扫描溶出伏安法沉积300s，得到处理后的玻碳电极；

步骤3：处理后的玻碳电极在扫描电位为+0.3～+1.3V，pH＝7.0的PBS中做循环伏安曲线直到获得稳定的电流电压曲线为止；

步骤4：:将此电极浸泡在20mM的戊二醛溶液中12～24h，得到戊二醛修饰的玻碳电极；

步骤5：用水充分清洗以除去玻碳电极上非化学吸附的戊二醛，把该电极浸入100μL HRP标记的CEA抗体溶液与200μL聚邻苯二胺纳米微球溶液的混合液中5～10h后得到聚邻苯二胺纳米微球/HRP标记的CEA抗体修饰电极；

步骤6：用水将电极冲洗干净，晾干；

步骤7：将干燥后的免疫传感器于含有0.04％BSA的PBS溶液中4℃下浸泡1～3h，将制备好的免疫传感器泡于4℃ 0.1M pH＝7.0的PBS中，即可得到癌胚抗原电化学免疫传感器。

2，检测方法

步骤1：取5μL的CEA标准样品配置成浓度为0.1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的溶液作为测试溶液，并在室温(25±1.0℃)下孵育10～60min；

步骤2：测试溶液在2.0mM H₂O₂和pH＝5.0～8.0无氧的PBS混合溶液中进行差分脉冲伏安扫描，其扫描电压为-0.5～-0.75V；

步骤3：启动电化学反应，分别测量0.1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的CEA溶液对应的电流强度，建立电化学电流强度与CEA溶液浓度之间的定量关系。

本方案的优点在于：

1，聚邻苯二胺纳米微球的制备采用臭氧作为氧化剂，不仅产物无污染，在氧化过程中也不会带入金属杂质。

2，这种免疫传感器中含有的聚邻苯二胺纳米微球带有正电荷的氨基与带负电的玻碳电极发生静电结合作用，聚邻苯二胺纳米微球同时与戊二醛反应，从而有利于酶的固定。聚邻苯二胺纳米微球和戊二醛应用于酶生物传感器中，构建电极与酶的氧化还原位点之间的直接电子转移，从而消除溶解氧的干扰。聚邻苯二胺具有固化酶、高的选择通透性、良好耐腐蚀性能，同时还具有丰富的氨基和亚氨基，有利于抗体蛋白质的功能化和提高酶的生物活性。