[发明专利]一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法

权利要求书

1.一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，所述的方法包括以下步骤：

A、RPS5的原核表达及工程菌破碎：

RPS5原核表达的工程菌用大肠杆菌，表达所用的LB培养基中添加1％～10％的葡萄糖或者甘油；

原核表达RPS5后，RPS5工程菌破碎方法为：4℃高速离心收集原核表达RPS5的工程菌的菌体，按照1g菌体湿重使用10mL第一缓冲液悬浮，置于冰上超声破碎，高速离心去掉上清，直到离心上清液淡黄色消失为止；所述的第一缓冲液为：40-60mmol/LNaH₂PO₄，pH 7.2，

B、RPS5变性蛋白阳离子交换层析纯化：

在第二缓冲液条件下溶解RPS5包涵体蛋白，高速离心去掉不溶物，上清液上样于阳离子交换层析柱，使用第二缓冲液充分洗涤杂蛋白，使用第三缓冲液再次充分洗去杂蛋白，最后使用第四缓冲液洗脱目的蛋白，

所述的第二缓冲液为：8mol/L尿素和40-60mmol/LNaH₂PO₄，pH 7.2；

所述的第三缓冲液为：8mol/L尿素、20mmol/L NaCl和40-60mmol/L NaH₂PO₄，pH 7.2；

所述的第四缓冲液为：8mol/L尿素、300mmol/LNaCl和40-60mmol/L NaH₂PO₄，pH 7.2，

C、RPS5变性蛋白阴离子交换层析纯化：

使用第八缓冲液透析从阳离子柱洗脱下来的目的蛋白溶液，在第八缓冲液条件下，将目的蛋白上样于阴离子交换柱，收集穿透液；

所述的第八缓冲液为：8mol/L尿素和10mmol/L-30mmol/LTris，pH 8.0

D、RPS5变性蛋白复性：

纯化好的RPS5变性蛋白溶液开始透析于第九缓冲液中6h以上，然后每隔3h使用预冷的第十缓冲液置换1/5、2/5、3/5、4/5体积的透析液，最后完全使用第十缓冲液透析蛋白溶液两次；高速离心得到的上清液即为复性的RPS5蛋白溶液；复性的RPS5蛋白溶液保存于4℃条件下；

所述的第九缓冲液为：8mol/L尿素、50mmol/L-150mmol/L Hepes和1mmol/LDTT，pH7.2；

所述的第十缓冲液为：50mmol/L-150mmol/LHepes和1mmol/LDTT，pH 7.2，

E、RPS5蛋白凝胶过滤层析纯化：

使用截留分子量为10kDa的超滤管浓缩复性好的RPS5蛋白，上样于预先使用第十缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱，使用第十缓冲液洗脱至出峰，收集蛋白峰。

2.根据权利要求1所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，其特征在于，

步骤A中，冰上超声破碎的参数为功率300w、工作时间3s、间隙时间3s、工作次数99次。

3.根据权利要求1所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，其特征在于，

步骤A中的RPS5的原核表达为：

原核表达载体的构建：PCR扩增两端带有Nco I酶和BamH I酶酶切位点的RPS5基因片段，上游引物如SEQ ID NO:1所示；下游引物为如SEQ ID NO:2所示；所使用的表达载体为pET-28a(+)，PCR扩增产物插入的酶切位点为Nco I和BamH I之间，使用质粒PCR法鉴定出阳性克隆；

原核表达：使用的工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)种，使用的培养基为添加了1％-10％的葡萄糖或者甘油的LB培养基，工程菌起始诱导菌液OD600＝1.6±0.1，诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.2mmol/L；诱导时间为3h；诱导温度为37℃。

4.根据权利要求1所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，其特征在于，

收集到的RPS5蛋白纯度达99％以上；浓度达3mg/mL以上。