[发明专利]检测GPCR之间相互作用及其交界面的方法

说明书

本发明提供用于检测GPCR之间相互作用及其交界面的方法，包括利用跨膜肽和MALDI‑TOF质谱法检测GPCR的二聚化及其交界面。

发明领域

本发明涉及生物检测技术，具体涉及检测GPCR之间相互作用及其交界面的方法。

背景技术

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)具有七次跨膜结构，其成员有800多个，其相关药物占市场上药物的40％-50％，因此是重要的药物靶点之一。最初认为GPCR是以单体形式存在并以单体的形式发挥作用。但在过去的二十年里越来越多的研究表明，GPCR能够在完整细胞中形成二聚体甚至高阶寡聚体。近期研究发现，视紫红质受体与β-arrestin结合的化学计量比由1∶1变为2∶1，这无疑证实了受体二聚体的存在。GPCR之间存在相互作用，其不同亚型及不同类型之间可以形成同源(相同受体)或异源(不同受体)二聚体，它们具有不同于单体的特异功能特征。GPCR的二聚化是调节受体功能的一种重要方式，受体-受体的相互作用可能形成较稳定的结构形式，并改变下游信号的G蛋白偶联从而产生二聚体特异的信号转导，并增加GPCR表型的多样性[10]。近年来的研究表明，GPCR同源或异源二聚体具有生理相关性。GPCR不论紧密相关，还是关系较远的都能够相互结合并且调节它们的活性，如μ阿片和CB1大麻素受体之间的相互作用影响神经突触形成(neuritogenesis)。大麻素/腺苷A2A受体二聚体影响大麻素在纹状体中介导的运动效应。另外，GPCR同源或异源二聚体具有疾病特异性，参与多种病理过程，使它们成为有吸引力的药物靶点。AT1R-B1R异源二聚化对于先兆子痫综合症(preeclampsia)的发生起关键作用，提高了血管紧张素II的敏感性，增强了AT1R的活性。为了进一步证实AT1-B2受体异源二聚化在高血压中所起的作用，对自发性高血压大鼠的肾小球系膜上检测发现AT1R-B1R异源二聚体含量增高。此外，APJ-AT1R异源二聚体能够抑制血管紧张素介导的动脉粥样硬化。Apelin作用APJ-AT1R异二聚体，从而拮抗血管紧张素II的信号转导途径。研究表明，GPCR二聚体还与疼痛、哮喘、帕金森等有关。因此，对GPCR之间相互作用的研究将有助于探寻相关疾病治疗的新突破点及新药开发。

近年来，随着X-射线晶体学发展，使得GPCR的高分辨率结构解析工作取得很大的进展，为解析更多的GPCR精确结构和功能及相关药物研发奠定重要基础。研究证实GPCR的A类受体二聚体的交界面主要是跨膜区，GPCR结构核心显示出7个跨膜区(Transmembrane，TM)。GPCR二聚体中，受体之间的相互作用涉及到二者跨膜区(交界面)构象的变化，了解二聚体结构的基础是识别它们的交界面(Interface)。目前，关于二聚体的交界面主要分为两大类，I型，二聚体的交界面主要为TM1，TM2和H8(helix 8)；II型，二聚体交界面主要为TM5以及部分TM4或TM6。。

发明内容

本发明提供用于检测GPCR之间相互作用及其交界面的方法，包括利用跨膜肽和MALDI-TOF质谱法检测GPCR的二聚化及其交界面。

本发明的一个方面提供用于检测GPCR之间相互作用及交界面的方法，包括以下步骤：

(1)合成包含第一GPCR的一个或多个跨膜肽的融合蛋白，其中每个融合蛋白包含第一GPCR的一个跨膜肽和连接在所述跨膜肽的氨基酸或羧基端的膜结合肽，所述膜结合肽能与细胞膜上存在的分子连接从而促进跨膜肽在细胞膜上整合，且每个融合蛋白中膜结合肽与跨膜肽连接的顺序使得所述融合蛋白中包含的第一GPCR跨膜肽在细胞中能以与天然状态相同的方式与膜结合；

(2)在细胞中表达全长第二GPCR，并用步骤(1)中合成的每个融合蛋白分别孵育细胞，然后提取细胞中蛋白，并用全长第二GPCR的抗体对所提取的蛋白分别进行免疫沉淀；

(3)取免疫沉淀的蛋白混合物分别进行基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析，根据分子量的大小判断每个跨膜肽和全长第一GPCR之间是否发生相互作用以及相互作用的交界面。