[发明专利]一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法在审
申请号: | 201611105349.7 | 申请日: | 2016-12-05 |
公开(公告)号: | CN106596760A | 公开(公告)日: | 2017-04-26 |
发明(设计)人: | 郑乃仁 | 申请(专利权)人: | 北京理工大学 |
主分类号: | G01N30/02 | 分类号: | G01N30/02;G01N30/89 |
代理公司: | 北京理工大学专利中心11120 | 代理人: | 周蜜,仇蕾安 |
地址: | 100081 *** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基于 两端 标记 数据库 搜索 蛋白质 鉴定 方法 | ||
1.一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法,其特征在于:所述方法步骤如下:
(1)对蛋白质进行如下处理:变性后,对其中含有的二硫键进行还原,然后用烷基化试剂封闭自由巯基;对处理后的蛋白质采用胞内蛋白酶赖氨酸-C进行酶切,形成多肽;
(2)使用化学/代谢标记对多肽N端的α-氨基和C端赖氨酸侧链氨基分别进行标记;在进行标记时,将多肽分成等量的两份,一份多肽中的N端采用含有轻同位素的标记试剂进行标记、C端采用含有重同位素的标记试剂进行标记,另一份多肽中的N端采用含有重同位素的标记试剂进行标记、C端采用含有轻同位素的标记试剂进行标记,标记完成的两份多肽间轻重同位素标记的相同肽段的分子量相差0Da~-0.1Da;
化学标记使用的标记试剂为与氨基发生反应的化学试剂;
进行代谢标记时,通过在细胞培养液中加入含有不同轻重同位素的赖氨酸和/或精氨酸,并且使含有待鉴定蛋白质的细胞在所述培养液中传代6次~8次;
所述不同轻重同位素为:12C、13C、14N、15N、H或氘;
(3)将标记后的两份多肽混合,使用一维或者二维液相色谱-质谱联用进行分离和鉴定,获得肽段质荷比信息;在进行PD,Pfind以及Mascot数据库搜索和肽段匹配时,根据同位素标记引起的N端轻标和重标b离子以及C端轻标和重标y离子与实验质谱图匹配程度计算候选肽段的得分值,进行多肽和蛋白质鉴定;对质谱采集到的每一条肽段的质谱图进行同样的操作,从而实现对蛋白质的鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法,其特征在于:步骤(1)中蛋白质的变性方式为热变性或尿素变性;使用二硫苏糖醇对二硫键进行还原;封闭自由巯基的烷基化试剂为碘代乙酰胺、碘乙酸、甲基甲烷巯基磺酸和N-乙基马来酰亚胺中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法,其特征在于:步骤(1)中胞内蛋白酶赖氨酸-C的用量为蛋白质质量的1%~10%。
4.根据权利要求1所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法,其特征在于:步骤(1)中使用10mM的二硫苏糖醇使蛋白质变性,变性时间为1h~2h;然后加入烷基化试剂,在黑暗中放置1h对蛋白质进行烷基化,得到处理后的蛋白质。
5.根据权利要求2所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法,其特征在于:步骤(1)中胞内蛋白酶赖氨酸-C的用量为蛋白质质量的1%~10%;使用10mM的二硫苏糖醇使蛋白质变性,变性时间为1h~2h;然后加入烷基化试剂,在黑暗中放置1h对蛋白质进行烷基化,得到处理后的蛋白质;加入胞内蛋白酶赖氨酸-C后在37℃下孵育过夜进行酶切。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法,其特征在于:使用尿素变性时,用pH值为7.5的50mM磷酸钠将处理后的蛋白质中的尿素浓度稀释到0.8M。
7.根据权利要求1所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法,其特征在于:步骤(2)中化学标记使用的标记试剂为碳链长度为1~10的醛、碳链长度为1~10的酸、碳链长度为1~10的酸酐、碳链长度为1~10的酰氯和碳链长度为1~10的酯中的一种以上。
8.根据权利要求1所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法,其特征在于:步骤(2)中进行化学标记时,将多肽溶解于缓冲溶液中得到多肽溶液,浓度为0.01mg/mL~10mg/mL,缓冲溶液pH值为5.0~9.0;将标记试剂溶解于缓冲溶液或者有机溶剂中,再与多肽溶液混合,标记试剂与多肽的摩尔比为5:1~200:1,化学标记反应时间为10min~2h,化学标记反应温度为4℃~90℃。
9.根据权利要求7所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法,其特征在于:步骤(2)中进行化学标记时,将多肽溶解于缓冲溶液中得到多肽溶液,浓度为0.01mg/mL~10mg/mL,缓冲溶液pH值为5.0~9.0;将标记试剂溶解于缓冲溶液或者有机溶剂中,再与多肽溶液混合,标记试剂与多肽的摩尔比为5:1~200:1,化学标记反应时间为10min~2h,化学标记反应温度为4℃~90℃。
10.根据权利要求1所述的一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法,其特征在于:步骤(3)中将两份等重标记的多肽混合后,进行一维或者二维液相色谱-质谱联用得到质谱数据后,首先对所述数据库中的蛋白质进行理论酶解,将酶解产生的肽段按照分子量大小排列,构成理论酶解肽段数据库;对多肽二级质谱图,首先根据其母离子的质荷比和电荷数计算分子质量,然后从理论酶解肽段数据库中选择分子量与其接近的肽段作为候选肽段库;对候选肽段库中的每一条肽段,根据其氨基酸序列构建理论N端和C端碎片离子质谱图;在构建所述理论质谱图时,根据标记方法引起的多肽质量变化,计算两种标记形式所形成的肽段的所有碎片离子,即轻标和重标N端离子以及轻标和重标C端离子的质荷比;将每一条候选肽段的理论质谱图与实验质谱图进行比较,根据理质谱图与实验质谱图的匹配度计算候选肽段的得分值,并根据得分值高低选择匹配程度最大的候选肽段作为鉴定结果。
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