[发明专利]一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，具体地说，涉及一种通过对多肽的氮(N)端和碳(C)端分别进行稳定同位素标记，并根据标记形成的轻标和重标b(N端)离子以及轻标和重标y(C端)离子计算候选肽段得分值，基于数据库搜索的方法进行多肽和蛋白质鉴定的方法，属于生物信息技术领域。

背景技术

蛋白质是重要的生物大分子，在生命活动中发挥着重要作用。对蛋白质进行测序对于蛋白质一级结构的分析至关重要。目前最常用的蛋白质鉴定方法是将蛋白质酶解形成肽段后，进行液相色谱分离和质谱鉴定，然后将肽段的实验质谱图与蛋白质数据库理论酶解后形成的肽段的理论质谱图进行比较，根据不同候选肽段的理论质谱图和实验质谱图的匹配程度，计算不同候选肽段的得分值，进而获得多肽和蛋白质鉴定结果。

为了对生物过程进行深入研究，不仅需要对蛋白质组进行定性，而且需要对生物不同状态下的蛋白质组进行准确定量。多肽两端稳定同位素标记方法是蛋白质组学中一种常用的定量方法，通过在多肽N端和C端分别进行稳定同位素标记，实现两个或者多个样品中的肽段质量相同或者相近，并且在色谱分离过程中具有相同或者相近的保留时间，从而在随后的质谱分析中同时碎裂，所形成的碎片离子具有一定的质量差；通过比较不同样品中碎片离子的质谱信号强度，实现不同样品中多肽和蛋白质的定量(Koehler CJ，Arntzen MO，Treumann A，Thiede B，Anal.Bioanal.Chem.，2012，404(4)，1103-1114)，所述标记方法利用稳定同位素标记形成的具有较高特异性的成对碎片离子进行定量，具有较好的定量准确度；然而，所述标记方法造成了多肽质谱图复杂度的成倍增加，不利于多肽的鉴定。目前的蛋白质鉴定算法，只以肽段的一种稳定同位素标记形式形成的碎片离子来计算候选肽段的得分值，而将另一种稳定同位素标记形式形成的碎片离子作为干扰离子，这样会降低候选肽段的得分值，严重影响多肽和蛋白质的鉴定效率。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，所述鉴定方法对多肽两端进行同位素标记后的蛋白质酶解产物，在使用液相色谱-质谱联用进行分离和检测后，在使用数据库搜索的方法进行鉴定时，通过构建包含两种标记形成的肽段的所有碎片离子的肽段理论谱图，并与实验质谱图进行匹配，实现对多肽的鉴定，进而鉴定得到蛋白质，提高了多肽和蛋白质鉴定的效率，可用于已知数据库蛋白质样品的高效鉴定。

为实现本发明的目的，采用如下技术方案。

一种基于两端等重标记和数据库搜索的蛋白质鉴定方法，所述方法步骤如下：

(1)对蛋白质进行如下处理：变性后，对其中含有的二硫键进行还原，然后用烷基化试剂封闭自由巯基；对处理后的蛋白质采用胞内蛋白酶赖氨酸-C进行酶切，形成多肽；

其中，优选蛋白质的变性方式为热变性或尿素变性；

优选使用二硫苏糖醇(DTT)对二硫键进行还原；

优选封闭自由巯基的烷基化试剂为碘代乙酰胺、碘乙酸、甲基甲烷巯基磺酸和N-乙基马来酰亚胺中的一种以上。

优选胞内蛋白酶赖氨酸-C的用量为蛋白质质量的1％～10％。

优选使用10mM DTT对蛋白质变性，变性时间为1h～2h；然后加入烷基化试剂，在黑暗中放置1h对蛋白质进行烷基化，得到处理后的蛋白质；

优选在使用尿素变性时，用pH值为7.5的50mM磷酸钠将处理后的蛋白质中的尿素浓度稀释到0.8M；

优选加入胞内蛋白酶赖氨酸-C后在37℃下孵育过夜进行酶切。

(2)使用化学/代谢标记的方法对多肽N端的α-氨基和C端赖氨酸侧链氨基分别进行标记；为了实现多肽碎片离子的分辨以及多肽母离子的同时碎裂，在进行标记时，将多肽分成等量的两份，分别使用含有不同轻重同位素的标记试剂进行标记，一份多肽中的N端采用含有轻同位素的标记试剂进行标记、C端采用含有重同位素的标记试剂进行标记，另一份多肽中的N端采用含有重同位素的标记试剂进行标记、C端采用含有轻同位素的标记试剂进行标记，标记完成的两份多肽间轻重同位素标记的相同肽段的分子量相差0Da～-0.1Da；

其中，化学标记使用的标记试剂为与氨基发生反应的化学试剂，如碳链长度为1～10的醛、碳链长度为1～10的酸、碳链长度为1～10的酸酐、碳链长度为1～10的酰氯和碳链长度为1～10的酯中的一种以上；