[发明专利]一种黄病毒人源单克隆抗体及应用

说明书

本发明公开了一种黄病毒人源单克隆抗体及应用，属于医药技术领域。本发明获得了3个可以与ZIKV‑E蛋白结合的抗体并确定了3个抗体的结合位点。本发明的3株抗体与已经报道的ZIKV抗体序列完全不同，是3个新发现的抗体。这三株抗体与ZIKV‑E的结合常数分别为39.9pM(Z5)，44.7pM(Z6)和200pM(Z7)，说明三株人源抗体均有很强的寨卡病毒E蛋白结合能力。通过竞争实验，三株抗体结合的位点都与2A10G6存在竞争关系，说明三株抗体结合位点在FL附近，而黄病毒科的E蛋白在FL处高度保守。本发明的抗体有效检测常见的黄病毒科的病毒：寨卡病毒，登革1‑4型以及黄热病毒的感染，巨大的临床检测及基础研究的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种黄病毒人源单克隆抗体及应用，属于医药技术领域。

背景技术

2015年中南美洲暴发寨卡疫情，目前已经造成69个国家数百万人感染，我国也出现数例输入性病例。随着人口的流动及气候变化，寨卡病毒在我国存在较高的流行风险。然而，由于寨卡病毒感染时，80％患者无明显症状，20％患者症状轻微，不会引起患者重视。寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)属于黄病毒科，主要由蚊虫叮咬传播。同时，寨卡病毒可以通过母胎屏障，造成新生儿小头症。除此之外，寨卡病毒可以通过性传播。临床数据显示寨卡病毒既可以通过男性患者传染女性，也可以通女性患者传染男性。并且，研究表明男性精液中的寨卡病毒可存活62天，在他发病42天后仍能将寨卡病毒通过性接触传染给女性伴侣。越来越多的证据表明寨卡病毒感染的危害超出我们的认识：如引起新生儿小头症和神经症状(“格林-巴利综合征”等)。最近的研究揭示寨卡病毒感染雄性小鼠可造成睾丸损伤，并最终导致不育。因此必须要对寨卡病毒持续监控及检测，尤其对于育龄人群的检测更为重要。另外，为了研究寨卡病毒及其它黄病毒的致病机制、评估疫苗和治疗性药物效果等，动物模型，如小鼠模型的研究必不可少，这也迫切需要亲和力高，背景低的抗体用于实验研究。

寨卡病毒是有囊膜的正链RNA病毒。囊膜上有E蛋白。E蛋白负责受体识别、结合及膜融合，含有重要的中和抗体表位。同时，E蛋白也是检测病毒的理想抗原。X-射线晶体学结构显示黄病毒E蛋白有三个结构域：DI，DII和DIII。DII头部(98-110位氨基酸)包含一个高度保守的融合区(fusion loop，FL)，在病毒入侵的膜融合过程中起关键作用。不同黄病毒FL区域保守性非常高，在病毒感染过程中，免疫细胞会产生大量的针对FL的抗体。

已有研究发现有一些针对黄病毒的广谱抗体，如：2A10G6、4G2，这些抗体都是通过鼠杂交瘤融合产生的针对FL的抗体，其中2A10G6与E蛋白的亲和力K_D＝2.7nM，4G2与E蛋白的亲和力未知，未见文献报道，因此在基础研究和临床检测中，可能存在亲和力较低，特异性不好，背景高的问题，一定程度上限制了抗体的使用及灵敏度。

本发明的目的是鉴定高亲和力的人源抗体，用于基础研究和临床检测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明以大肠杆菌表达的寨卡E蛋白作为抗原，从一例康复期寨卡患者的PBMCs中筛选到可以结合寨卡E蛋白的记忆B细胞。然后对筛选的单一B细胞进行RT-PCR，获得抗体的可变区序列与片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。经哺乳动物细胞表达、纯化后，检测与ZIKE-E蛋白的结合力。本发明获得了3株高亲力结合E蛋白的人源单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体，或抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列和/或轻链可变区的氨基酸序列，包含至少一个(比如三个)克隆Z5、克隆Z6或克隆克隆Z7的重链和/或轻链可变区的互补决定区(CDR)。

本发明的第一个目的是提供一种抗体，或抗原结合片段，其包含(A)或(B)或(C)或(D)：

(A)抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1的26-35位，53-59位，和/或98-105位的氨基酸残基，且抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:2的26-34位，52-54位，和/或91-100位的氨基酸残基；