[发明专利]一种生物法制备苯乙酸的方法

说明书

本发明提供了一种生物法制备苯乙酸的方法，其包括如下步骤：将苯乙腈分为若干批次，每批次的体积相等，每隔一定时间将一批次苯乙腈加入转化液中，然后在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应，待上一批次的苯乙腈的转化率达到一定程度后再加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的转化率达到一定程度后终止反应，得到苯乙酸；该转化液中包括含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌；本发明由于采用了MG腈水解酶和分批次加入苯乙腈相结合的方法制备苯乙酸，不仅工艺路线简单、反应条件温和以及没有污染，而且苯乙酸的积累浓度高达1M，具有良好的工业化应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种生物法制备苯乙酸的方法。

背景技术

苯乙酸是一种重要的有机化合物，由于其具有羧基、亚甲基氢和苯环的典型反应，可以生成多种中间体，因此在医药、香料、农药等行业应用广泛，尤其是在青霉素工业盐的生产上具有巨大的需求量。

目前，苯乙酸的合成路线多达数十种，其中常见的有：氰化钠法、苯乙烯法、苯乙酮法以及苄基卤化物羰化法。

国内苯乙酸的生产主要采用氰化钠法，该方法主要分为两步，首先由氯苄和氰化钠合成苯乙腈，随后通过酸碱水解法将苯乙腈转化为苯乙酸。然而，在苯乙腈水解生产为苯乙酸的过程中，由于需要强酸强碱的参与以及持续保持高温的过程，能耗较高。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种生物法制备苯乙酸的方法，该方法的反应条件温和、能耗低并且原料苯乙腈的转化率较高。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种生物法制备苯乙酸的方法，其包括如下步骤：

将苯乙腈分批次加入转化液中，在转化pH为6.0‐9.0和转化温度为20‐40℃的条件下反应5‐20个批次，待上一批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后终止反应，得到苯乙酸；

其中，苯乙腈所分批次的数目可以为7‐15，优选为8‐12。

下一批次的苯乙腈的添加时间为：待上一批次的苯乙腈的转化率达到80％‐95％后加入下一批次，优选为85％‐90％。

转化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌。该转化液的制备方法包括如下步骤：

(1)、将E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养，离心以得到静息细胞；

(2)、收集静息细胞，并将其悬浮在pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液。

每批次所加入的苯乙腈的量可以相等，为0.1‐20mL/g静息细胞，也可以为0.3‐10mL/g静息细胞，还可以为0.5‐1mL/g静息细胞。

在步骤(1)中，发酵培养基的组分及含量如下：酵母膏16‐60gL^‐1、蛋白胨12‐80gL^‐1、甘油1‐500mlL^‐1、K₂HPO₄ 24.75gL^‐1、KH₂PO₄ 3.47gL^‐1、MgSO₄ 1gL^‐1。

在步骤(2)中的转化液中，静息细胞的浓度大于10gL^‐1，优选为10‐100gL^‐1，更优选为10‐50gL^‐1，最优选为10‐20gL^‐1。