[发明专利]一种引入多胺标签的基因改造方法，脂肪酶的可溶表达及生物仿生固定化方法

权利要求书

1.一种实现其可溶、有活性表达的基因改造方法，其包括如下步骤：

以N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因作为目的基因，在脂肪酶亲本基因序列的N末端添加编码6个组氨酸的核苷酸序列，同时在脂肪酶亲本基因序列的C末端添加编码10个精氨酸或10个赖氨酸的核苷酸序列，并针对目的基因设计引物；通过PCR获得N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶6His-CalB-10Arg或6His-CalB-10Lys基因，其中，所述N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶6His-CalB-10Arg的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，以及所述N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶6His-CalB-10Lys的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

2.一种N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因，其结构如下：在脂肪酶亲本基因序列的N末端添加编码6个组氨酸的核苷酸序列，同时在脂肪酶亲本基因序列的C末端添加编码10个精氨酸或10个赖氨酸的核苷酸序列，由此形成N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶6His-CalB-10Arg或6His-CalB-10Lys基因，其中，所述N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶6His-CalB-10Arg基因的序列如SEQ ID NO:7所示，以及所述N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶6His-CalB-10Lys基因的序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种带有多胺标签的脂肪酶，其结构如下：在脂肪酶的N末端连接6个组氨酸，同时在脂肪酶C末端连接10个精氨酸或10个赖氨酸，由此形成N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶6His-CalB-10Arg或6His-CalB-10Lys，其中，所述N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶6His-CalB-10Arg的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，以及所述N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶6His-CalB-10Lys的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

4.含有权利要求2所述的N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因的重组表达质粒。

5.带有多胺标签的脂肪酶诱导仿生纳米硅的形成及固定化方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将权利要求3所述的带有多胺标签的脂肪酶用磷酸缓冲液稀释，制成酶液；

（2）正硅酸甲酯与HCL水溶液混溶，室温条件下匀速搅拌，使其充分水解，得到纳米硅前体；

（3）将纳米硅前体置于冰水浴中，加入步骤（1）制得的酶液，共固定化后，离心回收固定化样品，并用清洗缓冲液清洗固定化样品；除去未固定上的游离酶，得到固定化酶6His-CalB-10Arg或10Lys-SPs。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤（1）中，所述酶液中蛋白浓度为20~24mg/mL。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤（3）中，所述酶液和所述纳米硅前体的体积比为1：1。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤（3）中，所述共固定化在搅拌下进行，共固定化的时间为60~90 min。

9.根据权利要求5所述的方法得到的固定化酶6His-CalB-10Arg或10Lys-SPs在催化不对称有机合成反应和手性化合物拆分中的用途。