[发明专利]一种引入多胺标签的基因改造方法，脂肪酶的可溶表达及生物仿生固定化方法

说明书

本发明提供了一种实现其可溶、有活性表达的基因改造方法：以N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因作为目的基因，在脂肪酶亲本基因序列的N末端添加编码m个组氨酸、m个精氨酸或m个赖氨酸的核苷酸序列，m＝2～10，同时在脂肪酶亲本基因序列的C末端添加编码n个组氨酸、n个精氨酸或n个赖氨酸的核苷酸序列，n＝2～10，并针对目的基因设计引物；通过PCR获得N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因。该基因表达后产出可溶的带有多胺标签的脂肪酶，其可以诱导仿生纳米硅的形成及固定化。本发明在温和的条件下、短时间就可获得高活力和固定化效率的固定化酶；操作简便，固定化条件易控制、成本低。

技术领域

本发明涉及基因工程、蛋白固定化技术领域，具体地，本发明涉及用一种基因改造方法，在脂肪酶基因中引入多胺标签，可以有效实现脂肪酶在大肠杆菌中的可溶表达，产生带有多聚阳离子氨基酸标签的脂肪酶；该脂肪酶诱导硅酸聚集成硅颗粒，并通过电荷相互作用和离子间作用力将蛋白固定到硅粒子上，得到固定化酶及其应用。

背景技术

脂肪酶可以催化酯化、水解、转酯以及酰化等类型反应。在非水相催化合成中，很多脂肪酶，比如南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica Lipase B，CalB)，表现出了极好的活性和操作稳定性；在有机合成、手性化合物拆分、制药、医药中间体等领域得到广泛应用。

据报道CalB等脂肪酶在真核微生物，如毕赤酵母(Pichiapastoris)，米曲酶(Aspergillus-oryzae)等可进行良好表达，但是在真核表达系统操作繁琐，生长周期较长。大肠杆菌代谢途径和基因表达调控机制清楚，培养周期短，目标基因表达水平高，成为构建、表达的良好宿主菌。目前已有将CalB等脂肪酶在大肠杆菌中进行表达的报道，如liu等人利用还原酶缺陷性菌株Origami B结合带有冷启动子的PcoldIII载体，成功将CalB在大肠杆菌中表达，但是大量的重组蛋白质都形成不可溶的包涵体(《Functional expressionof Candida antarctica lipase B in the Escherichia coli cytoplasm—a screeningsystem for a frequently used biocatalyst》)。Blank等人也成功将CalB在细胞周质空间里进行表达，但表达量较低，且大量重组蛋白质仍以不可溶形式存在(《Functionalexpression of Candida antarctica lipase B in Escherichia coli》)。虽然后期Jung等人通过密码子优化，及表面疏水残基突变的方法提升了CalB在细胞周质空间的表达量(《Improving the expression yield of Candida antarctica lipase B inEscherichiacoli by mutagenesis》)，但是仍然没有彻底解决重组蛋白质以不可溶形式存在的问题。

脂肪酶应用广泛，但直接将游离态的天然酶投入使用、催化反应等通常会遇到一些问题，例如：游离酶在非水溶剂中不溶解，易聚集，极大地降低了酶的利用率；游离酶活性不稳定，易受外界环境因素(温度、PH值、离子强度)变化而失活；酶的分离困难，参与反应后的酶无法回收再利用。

由于存在以上种种不利因素，那么通过某些方法将酶与载体相结合成不溶于含有底物的体系中，从而使酶被集中或限制在一定的空间范围内进行酶解反应，使它与整个体系隔开；反应时能发挥作用，反应结束后可回收再利用，即酶固定化技术。固定化技术的应用可追溯到20世纪50年代，最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾称为“水不溶酶”和“固相酶”。1971年第一届国际酶工程会议上，正是建议采用“固定化酶”的名称。所谓固定化酶，是指在一定空间内程闭锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。

目前常用的酶固定化技术可归纳为共价结合、离子键固定、非共价吸附、酶交联和包埋法5类。近年来，受生物启发，通过模拟生物界面，利用生物分子识别和借鉴生物矿化等，发展了许多新的固定化方法，效果显著。