[发明专利]一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法

权利要求书

1.一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18-AIF表达基因，通过酶切方式与Abvec-Igk质粒连接，分别得到重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif；

2)取步骤1)所得重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif，在宿主细胞E.coli Top10中进行质粒扩增；

3)收集步骤2)扩增后的重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif，通过电转法导入处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株中，即得到载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009；所述电转法的操作条件是：电压1.8kv、电阻200Ω、电容25μ F的条件电转4.7ms；

4)取HEK293-T细胞与载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合，混合后培养4～16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40～56h，而后破碎细胞收集上清。

2.根据权利要求1所述的一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于步骤1)所述酶切方式是经AgeI和BsiwI双酶切，对酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Abvec-Igk质粒中。

3.根据权利要求1所述的一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于步骤3)所述处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株，是通过以下方法制备的：

A)取冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株划线接种于LB固体培养基培养至形成单菌落；

B)挑取单菌落接种于3～7mlLB液体培养基中，35～39℃振荡培养10～14h；

C)取步骤B)培养所得的菌液，按1:80～1:120的体积比接种于LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD值不小于0.4；

D)冰浴15～25min后，离心取沉淀用1/8～1/12体积预冷的无菌去离子水洗涤，而后离心取沉淀用1/80～1/120体积预冷的、8～12％mL/mL浓度的甘油洗涤菌体，再离心沉淀重悬于1/80～1/120体积预冷的、8～12％mL/mL的甘油中。

4.根据权利要求1所述的一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于HEK293-T细胞的加入量为8000～12000个/孔；HEK293-T细胞与载体菌株在细胞培养板中混合后每孔中液体总体积为380～420μL。

5.根据权利要求1所述的一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于所述针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素是青霉素和链霉素。