[发明专利]一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法

说明书

本发明提供了一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，该技术方案依托于一种特异性识别TEM1蛋白的单链抗体，结合减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的肿瘤内特异性聚集及胞内侵袭的特性，携带细胞凋亡诱导因子Aif达到特异性杀伤肿瘤的效果。具体来看，本发明首先构建了Abvec‑Igk‑Aif、Abvec‑Igk‑T18‑Aif重组质粒，经扩增后通过电击转化的方式导入鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株，利用减毒鼠伤寒沙门氏菌胞内侵袭的特性，以HEK293‑T细胞为宿主实现蛋白的表达，最后利用含青霉素、链霉素的血清培养基杀死细胞内外的减毒鼠伤寒沙门氏菌，使重组质粒释放至真核细胞中，经细胞破碎后即得到含有目的蛋白的上清液，该上清液即属于本发明所述药物的一种存在形式。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，进一涉及基因重组与转染方法的研究，同时涉及目的蛋白的表达及其功能验证，具体涉及一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法。

背景技术

细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)，是一类存在于线粒体内外膜之间的保守的黄素蛋白，可诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。人的AIF基因位于Xq25-26，其转录产生的mRNA的长度为2.4kb，编码产生的蛋白质有三个不同长度的可变剪接体，它们的氨基酸数分别为613、609和326。除可诱导细胞凋亡外，AIF兼具氧化还原酶的活性。

当细胞受到特定的凋亡诱导信号的刺激后，线粒体膜上的通透性孔道(mitochondrial permeability transition pores，MPTP)打开，允许AIF从线粒体释放到胞浆，并进入细胞核中，和另一个线粒体蛋白endonuclease G(Endo G)一起，引起核内DNA凝集并断裂成50kb大小的片段

在介导细胞凋亡过程时，AIF有两个方面的作用：一是可以作为细胞凋亡的起始因子，二是可以作为细胞凋亡的直接效应因子。在正常的情况下，AIF存在于线粒体中，可以清除细胞内的自由基从而阻止细胞凋亡；当细胞受到凋亡刺激后。AIF首先从线粒体出来，然后转移至细胞质中，最后转移到细胞核中发挥促进细胞凋亡的作用。

内皮唾液酸蛋白(TEM1/CD248)是Ⅰ型跨膜蛋白，由一个被糖基化修饰的80.9KDa的蛋白核心区组成，修饰后成熟的糖蛋白大约在175KDa。TEM1是近期发现的人类肿瘤标记物之一，其对肿瘤的细胞生长血管生成浸润及转移有重要作用。

TEM1外部分由五个球状结构域(N端的C型凝集素结构域，寿司样结构域，和三个表皮生长因子(EGF)样重复)和一个粘蛋白样区组成，其中核心蛋白大量唾液酸化与血栓调节蛋白相似。对于成体组织，TEM1的表达分布是这样的：子宫肾小球输卵管血管心和肺其他组织；另外，在内皮祖细胞中TEM1表达量相对很少。然而，在以下肿瘤中TEM1都有高表达，如肉瘤，脑肿瘤，乳腺癌，皮肤癌、结肠癌，且实验表明在卵巢癌中，TEM1表达与肿瘤的浸润、预后密切相关。因此，TEM1在正常组织不表达或者低表达，而在肿瘤血管组织高表达的特点，预示了TEM1作为肿瘤诊断和治疗的靶标分子的潜力。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，以解决现有技术中天然结构的细胞凋亡诱导因子AIF对肿瘤细胞的攻击缺乏靶向作用。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中缺乏一种AIF与抗体偶联的靶向抗肿瘤药物。

本发明要解决的再一技术问题是在获得了整合有AIF-单链抗体复合物的表达基因的重组质粒的情况下，现有技术中对此类质粒的表达方法操作繁琐、蛋白表达水平较低。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，包括以下步骤：