[发明专利]一种ZNF667蛋白的RNA干扰质粒及其应用方法

说明书

本发明公开了一种ZNF667蛋白的短发夹RNA干扰质粒及其应用方法。首次成功构建了ZNF667蛋白的短发夹RNA(ZNF667‑shRNA)干扰质粒，将其转染至肝癌细胞株HepG2中，构建稳定转染ZNF667‑shRNA质粒的细胞株。发现削减HepG2细胞中的ZNF667蛋白可以抑制HepG2细胞的增殖，浸润，侵袭迁移。裸鼠成瘤实验证实，削减HepG2细胞中ZNF667的表达可以从在体水平抑制成瘤。削减HepG2细胞中的ZNF667蛋白的表达，可能是通过促进P53,抑制Bcl‑2蛋白来达到抑制HepG2细胞的恶性程度。本发明将为肝癌的治疗提供新线索和途径，具有重大意义。

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学的技术领域，具体涉及ZNF667蛋白的短发夹RNA干扰质粒及其应用方法。

背景技术

ZNF667是在大鼠心肌缺血预适应中发现的一种表达上调的基因，通过与基因库的比对发现没有与之对应的序列，它是一个全新的基因，将其命名为ZNF667，Genbank登录号为 AY221750。通过生物信息学分析，发现与之对应的蛋白是一种KRAB型锌指蛋白，含有14个锌指结构，具有转录调控的作用。

ZNF667的ORF为1827bp，编码608个氨基酸。目前对于ZNF667相关功能研究结果如下：(1)ZNF667是一种新发现的KRAB型锌指蛋白，能抑制SRE和AP-1的转录活性，具有转录抑制作用；(2)ZNF667定位在细胞核内，主要在心脏和脑组织中表达，在肝、肾、骨骼肌、睾丸中表达次之，在其他组织表达则较少；(3)ZNF667基因在缺血、缺氧、炎症、氧化应激条件下表达增多，具有典型的应激反应性；(4)ZNF667在应激状态下促进细胞生长；(5)ZNF667具有抗心肌细胞凋亡作用，H₂O₂处理H₉C₂心肌细胞在瞬时转染ZNF667后能明显的抑制Fas等蛋白的表达，且这种抗凋亡作用与直接和Fas启动子结合而抑制其表达有关；ZNF667能抑制TNF-ɑ所致的细胞凋亡，且这种抗凋亡作用也与直接和Bid启动子结合而抑制其表达有关。(6)ZNF667过表达后可以通过抑制Bax和P53的表达。有关ZNF667 的功能学研究表明：脑星形细胞瘤病理级别的升高，ZNF667mRNA及蛋白的含量呈上升趋势，尤其是在恶性程度高的Ⅲ、Ⅳ级脑星形细胞瘤中，含量明显升高。但是ZNF667在其他癌中的表达，运用ZNF667短发夹RNA干扰质粒对癌症进行治疗，尚没有任何研究。

本发明通过使用ZNF667发夹干扰RNA(shRNA)质粒，转染HepG2肝癌细胞系,建立ZNF667稳定削减的肝癌细胞系，通过研究发现，HepG2-ZNF667-shRNA细胞系表现为细胞增殖减慢，克隆形成率减低，浸润与侵袭能力下降。裸鼠成瘤实验证实，抑制HepG2细胞中ZNF667的表达，可以从在体水平抑制HepG2细胞成瘤。本发明从细胞功能学水平和在体动物实验水平证实了削减HepG2肝癌细胞中的ZNF667蛋白的表达，可以抑制HepG2细胞的恶性度，起到治疗作用。

发明内容

本发明的目的是通过构建一种ZNF667蛋白的发夹短发夹RNA干扰质粒，探讨削减ZNF667 蛋白对HepG2细胞的生物学特性的影响，进而将这种质粒用于抑制肝癌的治疗。

一种ZNF667蛋白的短发夹RNA干扰质粒，根据ZNF667的序列设计能够产生干扰ZNF667 蛋白表达的siRNA的DNA片段，插入到短发夹RNA干扰载体中构建而成。

上述质粒以人ZNF667的mRNA序列为模板，以及载体启动子启动表达siRNA对序列的要求，设计合成能够产生干扰ZNF667蛋白表达的siRNA的DNA片段。

siRNA干扰的目标基因ZNF667序列如下：

siRNA-1：CGAATATCTCTCACACGACAT；

siRNA-2：CGCCAATCATTTCTTATTGAA；