[发明专利]一种敲除猪胚胎p66

权利要求书

1.一种敲除猪胚胎p66^shc基因的方法，其特征在于：所述方法包括以下操作步骤，

（1）设计 Oligo DNA 序列

在p66shc基因的表达 DNA 区域中设计一对 20bp 左右的 oligo DNA，可以通过在线工具设计；按照得分优先选择1-3对的Oligo合成；另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp；将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE，准备进行下面的实验；

（2）Oligo的连接

将合成的 2 条单链 Oligo DNA 稀释至 1μg/μl后，退火形成双链 DNA，再与载体连接；pGLKO是线性载体，无需酶切处理，可直接用于 T4 DNA连接酶连接反应；

（3）构建好的质粒转化与扩增

将上述产物按照常规分子克隆技术方法转化到大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩增培养后，大量提取质粒，得到构建好的包含敲除p66shc基因的CRISPR-Cas9系统的表达质粒，保存备用；

（4）质粒转染细胞验证敲除效率

首先解冻培养293T细胞，待生长培养传代2次后，进行转染操作；共转染前提，稀释至质粒浓度为1μg/μl，转染前48小时，接种细胞至备用生产慢病毒的孔板或是培养皿中，转染时，细胞汇合度为70%-80%为最佳感染状态，活力≥95%以上；以转染时间为起始点，一次收获时间为24h后收获上清，保存于4℃下，如长期保存则在-84℃下；接种适量靶细胞，加入上述收集的含有质粒的病毒颗粒溶液，混匀；将靶细胞有限稀释后，分到96孔板中进行单克隆培养，待细胞长好后，取 1000 个左右的细胞，提基因组；然后使用T7核酸内切酶初步筛选阳性克隆，并且对筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析，从而可以验证该p66shc基因CRISPR-Cas9系统的有效性；

（5）p66shc基因的CRISPR-Cas9系统构建

设计好上述质粒上Cas9的引物，试剂盒mMESSAGE mMACHINE Ultra Kit其扩增上述得到的Cas9 mRNA，同时用设计好的引物利用试剂盒MEGA shortscript扩增gRNA的序列；得到PCR产物后分别用1.5% 凝胶进行电泳，辨认其得到的片段大小；得到p66shc基因的CRISPR-Cas9系统mRNA 后，保存备用；

（6）猪p66shc基因敲除胚胎生产

把构建好的猪胚胎，在受精后17h进行胞质注射上述p66shc基因的CRISPR-Cas9系统mRNA，按照浓度为10ng/ul，其每个胚胎注射的总量为3 ul；在培养后，利用后续的系统检验该基因的敲除效果，评价其敲除效率；

（7）p66shc基因敲除结果验证

PCR克隆囊胚后的p66shc基因DNA序列，其引物设计注意得到的产物的突变位点不要位于中间比较好，利用T7内切酶酶切后，凝胶电泳分析，确认其是不是已经敲除；同时，还可以结合利用PCR产物测序后对比分析得出结论。