[发明专利]一种敲除猪胚胎p66

说明书

本发明提供一种利用CRISPR‑Cas9基因编辑方法敲除主胚胎中p66shc的方法，具体的操作步骤包括有：（1）设计Oligo DNA序列，（2）进行Oligo的连接，（3）构建好的质粒转化与扩增，（4）质粒转染细胞验证敲除效率，（5）p66shc基因的CRISPR‑Cas9系统构建，（6）猪p66shc基因敲除胚胎生产，（7）p66shc基因敲除结果验证；采用本方案有效降低体外胚胎培养过程中的ROS水平，从而通过减少体外培养过程中的损伤等，提高猪胚胎体外生产的效率，最终构建有效的猪胚胎体外生产体系。

技术领域

本发明主要涉及胚胎工程技术和基因工程领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR/Cas9基因编辑方法构建敲除p66^shc基因猪胚胎的方法。

背景技术

早期胚胎的发育与培养环境中的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平有很大的关系。已有研究结果显表明，过氧化氢的存在会诱导小鼠受精卵在体外培养过程中发生周期性停滞、凋亡、坏死等生物学事件^[13]。轻微的氧化损伤最初导致线粒体内膜去极化，线粒体基质和细胞内线粒体分布改变；研究发现用H₂O₂处理48h后，受精卵皱缩，72h后发育停滞，出现DNA碎片，表明在胚胎发育的早期，氧化损伤线粒体致线粒体功能不良，可能导致细胞周期停滞和凋亡的主要原因^[13]。有研究表明，胚胎p66^shc(66-kilodahon isoformof Shc gene products)的表达与ROS水平有着密切的关系，而且研究发现，发现牛早期胚胎发育阻滞中胚胎中的p66^shc mRNA水平要显著高于正常的胚胎^[10]。大约有14％左右的牛体外生产胚胎阻滞在分裂的2-4细胞阶段，在这些阻滞的胚胎中发现有大量的ROS存在，主要以H₂O₂形式存在，这些ROS的产生及数量随着在体外胚胎发育进程而增加；相对于体内胚胎，体外发育胚胎的ROS水平要高得多，产生的这些ROS会对胚胎产生不利的影响，会使得DNA链断裂及蛋白的氧化水平提高等^[17,18]。已有研究也表明，产生的ROS水平能够引起胚胎发生凋亡，影响胚胎体外发育的效率，同时研究表明p66^shc能够识别由ROS引起的DNA破坏^[1]。为此，通过降低胚胎内部p66^shc的表达，就能降低胚胎内ROS的产生，从而提高猪胚胎体外发育效率。

众所周知，CRISPR-Cas系统(clustered,regularly interspaced,shortpalindromic repeats-associated proteinsystems)是细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。CRISPR-Ca系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活样效应核酸酶(Transcriptionactivator-like effectornucleases,TALEN)相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在细胞或斑马鱼中显示出相似甚至更高的效率。CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为选择性基因组编辑提供了一个简便而强大的工具。在实际应用中，CRISPR/Cas系统通常会把两个编码trancRNA与crRNA的基因结合成一个单链向导RNA(sgRNA)，即现在运用的CRISPR/Cas系统主要是由Cas9蛋白和sgRNA组成。该体系其中一个最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的sgRNA(small guide RNA)的引导下同时修饰多个基因组靶点。

基于上述的思路，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑方法在胚胎早期(原核注射方法)，敲除掉p66^shc基因，降低胚胎的ROS表达，通过筛选阳性胚胎，进行后续的研究性工作，从而最终建立高效的猪胚胎体外生产技术体系。

发明内容